Hinweis: Ergänzende Daten zu diesem Artikel sind bei Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/) verfügbar.E. Ladewig, F. Michelini und K. Jhaveri haben zu gleichen Teilen zu diesem Artikel beigetragen.Erik Ladewig, Flavia Michelini, Komal Jhaveri, Pau Castel, Javier Carmona, Lauren Fairchild, Adler G. Zuniga, Amaia Arruabarrena-Aristorena, Emiliano Cocco, Ryan Blawski, Srushti Kittane, Yuhan Zhang, Mirna Sallaku, Laura Baldino, Vasilis Hristidis, Sarat Chandarlapaty, Omar Abdel-Wahab, Christina Leslie, Maurizio Scaltriti, Eneda Toska;Die onkogene PI3K-induzierte transkriptomische Landschaft zeigt Schlüsselfunktionen beim Spleißen und der Regulation der Genexpression.Cancer Res 15. Juni 2022;82 (12): 2269–2280.https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-0446Der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Weg reguliert die Proliferation, das Überleben und den Metabolismus und wird häufig bei menschlichen Krebsarten aktiviert.Eine umfassende Aufklärung darüber, wie dieser Signalweg Transkriptions- und Kotranskriptionsprozesse steuert, könnte neue Einblicke in die Schlüsselfunktionen der PI3K-Signalübertragung bei Krebs liefern.Hier haben wir einen transkriptomischen Ansatz verfolgt, um die genomweite Genexpression und Änderungen der Aktivität von Transkriptionsfaktoren sowie das Spleißen und die Nutzungsdynamik von Isoformen stromabwärts von PI3K zu untersuchen.Diese Analysen deckten weit verbreitete alternativ gespleißte Isoformen auf, die mit Proliferation, Metabolismus und Spleißen in PIK3CA-mutierten Zellen verbunden sind, die durch Hemmung von PI3Kα umgekehrt wurden.Die Analyse von gepaarten Tumorbiopsien von Patientinnen mit PIK3CA-mutiertem Brustkrebs, die sich einer Behandlung mit PI3Kα-Inhibitoren unterziehen, identifizierte weit verbreitete Spleißveränderungen, die spezifische Isoformen gemeinsam mit den präklinischen Modellen betreffen, und diese Veränderungen, nämlich PTK2/FRNK- und AFMID-Isoformen, wurden als funktionelle Treiber validiert des Wachstums oder der Migration von Krebszellen.Mechanistisch vermittelten isoformspezifische Spleißfaktoren das PI3K-abhängige RNA-Spleißen.Die Behandlung mit Splicing-Inhibitoren machte Brustkrebszellen empfindlicher gegenüber dem PI3Kα-Inhibitor Alpelisib, was zu einer stärkeren Wachstumshemmung führte als Alpelisib allein.Diese Studie liefert die erste umfassende Analyse weit verbreiteter Spleißveränderungen, die durch onkogenes PI3K bei Brustkrebs verursacht werden.Der Atlas der PI3K-vermittelten Spleißprogramme legt eine Schlüsselrolle für den PI3K-Signalweg bei der Regulierung des Spleißens fest und eröffnet neue Wege zur Nutzung der PI3K-Signalübertragung als therapeutische Schwachstelle bei Brustkrebs.Die transkriptomische Analyse zeigt eine Schlüsselrolle des PI3K-Signalwegs bei der Regulierung des RNA-Spleißens und deckt neue Mechanismen auf, durch die PI3K die Proliferation und den Metabolismus bei Brustkrebs reguliert.Siehe den zugehörigen Kommentar von Claridge und Hopkins, S.2216Der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Signalweg steuert mehrere zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Proliferation, Metabolismus, Translation, Überleben und Apoptose.Eine aberrante Hyperaktivierung dieses Signalwegs nach Gain-of-Function-Mutationen in PIK3CA, dem Gen, das für die katalytische Untereinheit von PI3K (p110α) kodiert, trägt zu multiplen Entwicklungsstörungen, Krebs und Behandlungsresistenz bei verschiedenen Tumorarten bei.Mutationen in PIK3CA werden in bis zu 40 % der Östrogenrezeptor-positiven (ER+) HER2-negativen primären und metastasierten Brusttumoren gefunden (1–4), und die Kombination des PI3Kα-spezifischen Inhibitors Alpelisib mit dem ER-Degrader Fulvestrant ist von zugelassen die FDA für die Behandlung von Patienten mit ER+, PIK3CA-mutiertem Brustkrebs (5).Mehr als 95 % der menschlichen Gene codieren mehrere mRNA-Isoformen als Ergebnis des alternativen Spleißens, d. h. der unterschiedlichen Auswahl von intronischen/exonischen Sequenzen und der Verwendung alternativer Promotoren und Polyadenylierungsstellen am 3'-Ende, was die Proteindiversität erhöht (6, 7) .RNA-Spleißen ist ein kotranskriptionaler enzymatischer Prozess, durch den eine Vorläufer-mRNA in die reife mRNA umgewandelt wird, indem die nicht-kodierenden Regionen, die Introns, und die Ligation der kodierenden Regionen, der Exons (8), umgewandelt werden.Alternatives RNA-Spleißen bestimmt die Zelldifferenzierung, Entwicklung und Gewebeidentität (9), und fehlreguliertes Spleißen kann zur Tumorentstehung sowie zur Tumorentwicklung und Therapieresistenz beitragen (8, 10).Frühere Studien haben berichtet, dass der PI3K/AKT/mTOR-Weg die Funktion der Serin/Arginin-reichen (SR) Spleißfaktoren direkt reguliert (11–14).Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der PI3K-Signalweg das alternative Spleißen indirekt beeinflusst, indem er die Aktivität der SR-Proteinkinasen, SRPKs, moduliert (15–18).Es wurde gezeigt, dass AKT mit SRPKs interagiert und deren Autophosphorylierung und Kerntranslokation induziert, um SR-Proteine ​​zu aktivieren und alternatives Spleißen zu beeinflussen (17).Es wurde auch gezeigt, dass die duale Hemmung von PI3K und mTOR den Spleißfaktor hnRNPM hochreguliert und alternatives Spleißen in Ewing-Sarkom-Zellen induziert (19).Im Vergleich zu den umfangreichen Studien zu Proteinmodifikationen und Signalereignissen, die onkogenen PI3K-Varianten nachgeschaltet sind, wurde jedoch noch keine systematische und umfassende Untersuchung des Transkriptoms und des genomweiten alternativen Spleißens durchgeführt, das durch mutierte PI3K bei Brustkrebs moduliert wird.In dieser Studie wollten wir die genomweiten transkriptionellen Veränderungen und das alternative RNA-Spleißen und die Dynamik der Verwendung von Isoformen, die durch die Aktivierung des PI3K-Signalwegs in PIK3CA-Mutantenmodellen angetrieben werden, umfassend aufklären und ihre translationale Relevanz bei Brustkrebspatientinnen hinterfragen.Unsere Studie liefert die erste umfassende Analyse weit verbreiteter Spleißveränderungen, die durch onkogene PI3K bei Brustkrebs verursacht werden.Isogene Eltern- und heterozygote PIK3CAH1047R-Mutanten wurden von Horizon Discovery erworben.MCF-10A-Zellen wurden in DF-12-Medium gehalten, das mit 5 % gefiltertem Pferdeserum (Invitrogen), EGF (20 ng/μl; Sigma), Hydrocortison (0,5 mg/ml; Sigma), Choleratoxin (100 mg/ml; Sigma), Insulin (10 μg/ml; Sigma) und 1 % Penicillin/Streptomycin.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden in 6-Multiwell-Platten unter regulären Kulturbedingungen ausgesät, um eine korrekte Anheftung zu ermöglichen und eine Konfluenz von 75 % am Tag der Ernte sicherzustellen.Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) zugegeben wurde.Wo angegeben, wurden die Zellen mit DMSO als Kontrolle oder Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077 (100 nmol/l), GDC0068/ipatasertib (1 μmol/l) oder RAD001/Everolimus behandelt ( 100 nmol/l).Für die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und RT-qPCR-Experimente und zur Kontrolle der PI3K-Signalgebung durch Western Blot wurden die Zellen 4 Stunden lang behandelt, während für Western Blot-Analysen von PTK2/fokale Adhäsionskinase-verwandte Nicht-Kinase (FRNK)-Zellen 24 Stunden behandelt wurden.Embryonale Mausfibroblasten (MEF) wurden über ein Material Transfer Agreement (MTA; Ref. 20) erhalten und mit adenoviralem GFP (Elternzellen) oder adenoviralem Cre infiziert, um eine homozygote Pik3caH1047R-Mutation (Mutantenzellen) zu erhalten.MEFs wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert.MCF7 wurden von ATCC (ATCC HTB-22) bezogen und in DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin 1 %, unter Standardbedingungen gezüchtet.T47D wurden von ATCC (HTB-133) erworben und in RPMI, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin 1 %, unter Standardbedingungen gezüchtet.Alle Zellen wurden routinemäßig negativ auf Mycoplasma getestet.Die PI3Ka-spezifischen Inhibitoren Alpelisib und GDC0077, das PI3Kα/γ/δ Taselisib, der Pan-AKT-Inhibitor GDC0068/Ipatasertib, der mTORC1-Inhibitor RAD001/Everolimus wurden gekauft (Selleckchem).Der ON-TARGETplus Short-Interference RNA (siRNA) Smart Pool gegen SRSF1 (L-018672–01–0005), SRSF2 (L-019711–00–0005), SRSF3 (L-030081–00–0005), SRSF7 (L -015909–00–0005), CELF1 (:L-020166–00–0005), HNRNPC (L-011869–03–0005), TRA2B (L-007278–00–0005), AFMID (L-032645–02– 0005) und PTBP1 (L-003528–00–0005) oder Non-Targeting (D-001810–10–05) wurden von Horizon Discovery erworben.Mutante MCF10A-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen bei 30 % Konfluenz ausplattiert und 16 Stunden später wurden siRNA-Oligonukleotide unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific, 13778150) gemäß dem Protokoll des Herstellers bei einer Endkonzentration von 20 nmol/l transfiziert.Nach 72 Stunden wurden mutierte MCF10A-Zellen mit Alpelisib (1 μmol/L) in Hungermedien für 4 Stunden behandelt und dann für die RNA-Extraktion gesammelt.Die RNA wurde unter Verwendung des QIAGEN RNeasy Kits isoliert und die Retrotranskription wurde unter Verwendung des iScript cDNA-Synthesekits von Bio-Rad gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.cDNA wurde durch quantitative Echtzeit-PCR in einem ViiA 7-Echtzeit-PCR-System unter Verwendung von SYBR Select Master Mix von Applied Biosystems amplifiziert.Sequenzen der verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 gezeigt.Für Validierungsexperimente wurden MCF10A-Eltern- und -Mutantenzellen in 6-Multiwell-Platten unter regulären Kulturbedingungen ausgesät, um eine korrekte Anheftung zu ermöglichen und eine Konfluenz von 75 % am Tag der Ernte sicherzustellen.Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) zugegeben wurde.Die Zellen wurden dann mit DMSO oder mit den verschiedenen Inhibitoren des PI3K-Signalwegs in Hungermedien für 4 Stunden bei –37 °C behandelt.Die Zellen wurden dann schockgefroren und bis zur RNA-Extraktion bei –80 °C gelagert.Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.RNA aus MCF10A-Zellen wurde mit dem Illumina HiSeq 2000-Instrument bei 2 × 150 Nukleotid-Paired-End-Reads sequenziert.RNA aus MEF-Zellen wurde mit dem Illumina HISeq 2000-Instrument bei 2 × 100 Nukleotid-Paired-End-Reads sequenziert.Informationen zu RNA-seq-Analysen finden Sie unter Ergänzende Daten.Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer, ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Roche), lysiert.Gesamtproteinlysate wurden in Nupage 4 % bis 12 % Bis-Tris-Gradienten-Fertiggelen (Invitrogen) in MOPS-Puffer laufen gelassen.Membranen wurden unter Verwendung spezifischer Antikörper sondiert: PTK2/FAK (#3285S; RRID: AB_2269034) phosphoryliertes AKT (pAKT) (S473; #4060; RRID: AB_2315049), pAKT (T308; #13038; RRID: AB_2629447), Gesamt-AKT (# 4691; RRID: AB_915783), pS6 (S240/244; #5364; RRID: AB_10694233), pS6 (S235/236; #4858; RRID: AB_916156), HA-Tag (#3724; RRID: AB_1549585), V5-Tag (#13202; RRID: AB_2687461), β-Aktin (#4970S; RRID: AB_2223172) und Vinculin (#13901; RRID: AB_2728768) wurden von Cell Signaling Technology bezogen.Derselbe Antikörper wurde verwendet, um sowohl PTK2/FAK (125 kDa) als auch FRNK (43 kDa) nachzuweisen.Alle primären Antikörper wurden 1:1.000 verdünnt und sekundärer Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (GE Healthcare; RRID: AB_772206) (1:10.000) wurde verwendet.Die AFMID-202-Isoform wurde von Genewiz in einem pUC57-Vektor mit attB1- und attB2-Stellen in 5' bzw. 3' der cDNA bestellt und synthetisiert.Der Spenderklon wurde mit pLx302 (Addgene #25896) oder pIND20 (Addgene #44012) lentiviralen Vektoren unter Verwendung von Standard-Clonase II LR-Mix (Thermofisher; Katalog-Nr. 11791100) rekombiniert.Die Gateway-LR-Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.Nach effizienter Transformation und DNA-Reinigung wurden die Klone vor der Verwendung sequenziert.Als Vektorkontrolle für pLx302 AFMID-202 wurde pLx302 Luciferase verwendet.MCF10A PIK3CAH1047R-, MCF7- und T47D-Zellen, die Tet-FRNK-EGFP oder pIND20 AFMID-202 stabil exprimieren, wurden 24 Stunden vor dem Initiationsassay gleichmäßig in einer 48-Well-Platte (104) in 3 biologischen Wiederholungen für jeden Zustand ausgesät.Für die Zelllinien, die stabil Doxycyclin-induzierte Vektoren tragen, wurde volles oder 1 mg/ml Doxycyclin enthaltendes Medium hinzugefügt.Die Zellzahl wurde am Tag 0, 3 und 6 mit einem Countess 3 Automated Cell Counter (Thermofisher Scientific) gezählt.MCF10A-PIK3CAH1047R-Mutantenzellen, die stabil einen Doxycyclin-induzierbaren Vektor für FRNK-EGFP-Überexpression tragen, wurden 48 Stunden vor dem Assay in eine 12-Multiwell-Platte (1,5 × 105) ausgesät, um am Tag des Assays eine vollständig konfluente Monoschicht zu erhalten.24 Stunden nach dem Ausplattieren wurde 1 mg/ml Doxycyclin zu den Medien gegeben, um die FRNK-EGFP-Expression zu induzieren.Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion wurde eine ausreichende FRNK-EGFP-Expression unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Evos M5000, Thermo Fisher Scientific) bewertet.Als nächstes wurde eine gerade Wunde in der Mitte jeder Vertiefung unter Verwendung einer sterilen p200-Spitze geschabt, um eine Lücke in der konfluenten Monoschicht zu erzeugen.Die Vertiefungen wurden dann vorsichtig mit Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) gewaschen, um abgelöste Zellen zu entfernen, und mit frischem Hungermedium aufgefüllt.Die Wunden wurden unter Verwendung des Mikroskops Evos M5000 (Thermo Fisher Scientific) unmittelbar nach dem Schaben (Zeit 0 Stunde) und zu verschiedenen Zeitpunkten für eine Dauer von maximal 24 Stunden abgebildet, um den Beitrag der Zellproliferation zum Füllen der Lücke zu reduzieren.Die Wundfläche wurde mit FiJi (ImageJ) quantifiziert.MCF7- und T47D-Elternzellen wurden gezählt und 5.000 Zellen/Vertiefung wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und über Nacht in Vollmedium inkubiert.Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 1 × PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne FBS) hinzugefügt wurde.Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit steigenden Dosen von Alpelisib in Gegenwart von H3B-8800 (50 nmol/L), E7070 (100 nmol/L) oder DMSO-Kontrolle für 5 Tage behandelt.Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Zellproliferations-MTT-Kit (Sigma-Aldrich-Kat.-Nr. 11465007001) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.Für die T47D-Xenotransplantatstudie wurden 0,72 mg/90d-Freisetzungs-Östrogenpellets in 6 Wochen alte weibliche athymische Nacktmäuse 3 Tage vor der Tumorzelltransplantation implantiert.Zehn Millionen T47D-Zellen pro Maus wurden orthotop transplantiert.Für die MCF7-Xenotransplantat-Studie wurden 0,18 mg/90d-Freisetzungs-Östrogenpellets in 6 Wochen alte weibliche NOD-scid-Gamma-Mäuse 3 Tage vor der Tumorzelltransplantation implantiert.Zehn Millionen MCF7-Zellen pro Maus wurden subkutan transplantiert.Das von Patientinnen stammende Brustkrebs-Xenotransplantat mit PIK3CAH1047R-Mutante wurde wie folgt erzeugt: 6 Wochen alten weiblichen NOD-scid-Gamma-Mäusen wurden subkutan Proben implantiert, die frisch von Patienten im Memorial Sloan Kettering (MSK) unter einem von MSK genehmigten Institutional Review Board (IRB) entnommen wurden ) Bioprobenprotokoll Nr. 06–107.Tumore entwickelten sich innerhalb von 2 bis 4 Monaten und wurden durch serielle Transplantation auf weitere Mäuse ausgedehnt.Die Behandlung wurde begonnen, als das Tumorvolumen etwa 200 mm3 erreichte.Xenotransplantate wurden randomisiert und mit Alpelisib (25 mg/kg, oral 5 Tage die Woche) oder Vehikel als Kontrolle (0,5 % Methocel, oral 5 Tage die Woche) dosiert.Am Ende der Behandlungen (20–30 Tage) wurden die Tiere getötet und Tumore für Western Blot und RNA-Analysen gesammelt.Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien gehalten, die vom MSK Institutional Animal Care and Use Committee und dem Research Animal Resource Center genehmigt wurden.Patienten mit bekannten PIK3CA-Mutationen wurden in eine offene Phase-I-Dosiseskalationsstudie mit täglich oralem GDC-0077 allein (Arm A) in Kombination mit einer endokrinen Therapie mit oder ohne Palbociclib aufgenommen (Arm C: GDC-0077 + Letrozol; ARM D: GDC-0077 + Fulvestrant; Arm B: GDC-0077 + Letrozol + Palbociclib; Arm E: GDC-0077 + Fulvestrant + Palbociclib; Arm F: GDC-0077 + Fulvestrant + Palbociclib + Metformin-Prophylaxe; NCT03006172).Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.Die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien (Belmont-Bericht) durchgeführt.Die Patienten wurden in MSK-IRB Nr. 12–245 aufgenommen, und es wurde eine Kernbiopsie entnommen und für RNA-seq-Analysen verwendet.Weitere Einzelheiten zur Aufnahme von Patienten in diese Studie finden Sie in der ergänzenden Datendatei.Informationen zur Patientenkohorte finden sich in der Ergänzungstabelle S2.Für jedes unabhängige In-vitro-Experiment wurden mindestens drei Experimente durchgeführt, um eine angemessene statistische Aussagekraft zu gewährleisten.Einweg-ANOVA und ungepaarter t-Test wurden auf dem GraphPad PRISM durchgeführt, um Proben in RT-qPCR- bzw. RIP-qPCR-Experimenten zu vergleichen (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001) .Alle Informationen zu durchgeführten statistischen Tests, 'n'-Werten und P-Werten pro Experiment finden Sie in den Abbildungslegenden, Abbildungen und Ergebnissen.Das für alle statistischen Analysen verwendete Konfidenzniveau betrug 0,95 (α = 0,05), sofern nicht anders angegeben.Rechnerische Analysen und Statistiken aller Assays sind in der ergänzenden Datendatei enthalten.Die während dieser Studie generierten Datensätze [RNA-seq/assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq) fastq files] sind in der Gene Expression Omnibus-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE157858 verfügbar.Die Patienten-RNA-seq-fastq-Dateien sind in der dbgap-Datenbank unter der Nummer: phs002840.v1.p1 verfügbar.Um die dem PI3K-Weg nachgeschaltete globale Transkriptomregulation zu verstehen, führten wir Paired-End-Long-Read-RNA-Seq in zwei isogenen Knock-in-Zellmodellen durch, die die aktivierende Mutation PIK3CAH1047R tragen: MEFs und humane nichtmaligne Brustepithelzellen (MCF10A).(Ergänzende Abb. S1A; Ergänzende Abb. S1B und S1C).Um die Auswirkungen der PI3K-Hemmung zu beurteilen, führten wir in beiden Modellen nach der Behandlung mit PI3Kα-spezifischen Inhibitoren auch RNA-seq durch.Eine Analyse der differentiellen Genexpression ergab, dass Tausende von Genen durch PIK3CAH1047R im Vergleich zu elterlichen Kontrollzellen in MCF10A und MEF verändert wurden (Abb. 1A; ergänzende Abb. S1D–S1F), deren Expression auch durch PI3Kα-Hemmung umgekehrt wurde (Abb. 1B; Ergänzende Abb. S1G, Ergänzende Tabelle S3).Diese Beobachtungen zeigten, dass PIK3CAH1047R in erster Linie für Veränderungen der Genexpression in diesen isogenen Modellen verantwortlich war.Globale Veränderungen der Genexpression und des RNA-Spleißens im Zusammenhang mit der Expression des mutierten PIK3CA-Signalwegs.A, Venn-Diagramm-Überlappung von differentiell exprimierten Genen mit einem FDR-angepassten P < 0,05 und einem absoluten Fold Change > 0,2 unter Vergleichen: mutante vs. parentale, mutante + Alpelisib vs. mutante und parentale + Alpelisib vs. parentale MCF10A-Zellen.B, Streudiagramm der log2-fachen Veränderungen der Genexpression in MCF10A-Mutante vs. Eltern auf der x-Achse und Mutante + Alpelisib vs. Mutante auf der y-Achse.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Gene (FDR < 0,05 und absolute fold change > 0,2);graue Punkte, nicht signifikant differentielle Gene.Pearson-Korrelationskoeffizient r ist für alle Punkte in grau oder signifikant unterschiedliche Gene, rote Punkte, dargestellt.C, C2 Reaktom-mRNA-Spleißweg-Anreicherung in den angegebenen Vergleichen.D, Streudiagramm der log2-fachen Änderungen von JunctionSeq, das Mutante vs. Elternzellen auf der X-Achse und Mutante + Inhibitor vs. Mutante MCF10A-Zellen auf der Y-Achse zeigt;Ereignisse, die in PI3K-Aktivierungs- und PI3K-Hemmungsgruppen oder nur in PI3K-Aktivierungs- oder nur PI3K-Hemmungsgruppen signifikant sind, sind rot, orange bzw. blau.E, Venn-Überlappung von Genen, die signifikant unterschiedliche exonische Regionen enthalten.Der Schnittpunkt der gleichen signifikant unterschiedlichen exonischen Regionen mit entgegengesetzter log2-facher Änderung bei Mutante vs. Eltern und Mutante + Alpelisib vs. Mutante wurde 188 einzigartigen Genen zugeordnet.F, Der Prozentsatz von alternativ gespleißten Isoformen wurde unter Verwendung von 8 möglichen Transkriptionsereignissen kommentiert.MES, multiples Exon-Skipping;ATSS, alternative Transkriptionsstartstelle;ATTS, alternative Transkriptionsterminationsstelle;ES, Exon-Skipping;IR, Intronretention;A3, alternative 3'-Spleißstellen;A5, alternative 5'-Spleißstellen;MEE, sich gegenseitig ausschließende Exons.G, ein MA-Diagramm von Isoformen.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Isoformen;blaue Punkte, nicht signifikante alternativ gespleißte Isoformen.Validierte Kandidaten werden mit Isoform-Namen gekennzeichnet.Globale Veränderungen der Genexpression und des RNA-Spleißens im Zusammenhang mit der Expression des mutierten PIK3CA-Signalwegs.A, Venn-Diagramm-Überlappung von differentiell exprimierten Genen mit einem FDR-angepassten P < 0,05 und einem absoluten Fold Change > 0,2 unter Vergleichen: mutante vs. parentale, mutante + Alpelisib vs. mutante und parentale + Alpelisib vs. parentale MCF10A-Zellen.B, Streudiagramm der log2-fachen Veränderungen der Genexpression in MCF10A-Mutante vs. Eltern auf der x-Achse und Mutante + Alpelisib vs. Mutante auf der y-Achse.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Gene (FDR < 0,05 und absolute fold change > 0,2);graue Punkte, nicht signifikant differentielle Gene.Pearson-Korrelationskoeffizient r ist für alle Punkte in grau oder signifikant unterschiedliche Gene, rote Punkte, dargestellt.C, C2 Reaktom-mRNA-Spleißweg-Anreicherung in den angegebenen Vergleichen.D, Streudiagramm der log2-fachen Änderungen von JunctionSeq, das Mutante vs. Elternzellen auf der X-Achse und Mutante + Inhibitor vs. Mutante MCF10A-Zellen auf der Y-Achse zeigt;Ereignisse, die in PI3K-Aktivierungs- und PI3K-Hemmungsgruppen oder nur in PI3K-Aktivierungs- oder nur PI3K-Hemmungsgruppen signifikant sind, sind rot, orange bzw. blau.E, Venn-Überlappung von Genen, die signifikant unterschiedliche exonische Regionen enthalten.Der Schnittpunkt der gleichen signifikant unterschiedlichen exonischen Regionen mit entgegengesetzter log2-facher Änderung bei Mutante vs. Eltern und Mutante + Alpelisib vs. Mutante wurde 188 einzigartigen Genen zugeordnet.F, Der Prozentsatz von alternativ gespleißten Isoformen wurde unter Verwendung von 8 möglichen Transkriptionsereignissen kommentiert.MES, multiples Exon-Skipping;ATSS, alternative Transkriptionsstartstelle;ATTS, alternative Transkriptionsterminationsstelle;ES, Exon-Skipping;IR, Intronretention;A3, alternative 3'-Spleißstellen;A5, alternative 5'-Spleißstellen;MEE, sich gegenseitig ausschließende Exons.G, ein MA-Diagramm von Isoformen.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Isoformen;blaue Punkte, nicht signifikante alternativ gespleißte Isoformen.Validierte Kandidaten werden mit Isoform-Namen gekennzeichnet.Die Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA; Ref. 21) identifizierte die Zellproliferation (MYC- und E2F-Ziele, G2-M-Checkpoint) und den Stoffwechsel (Glykolyse, Fettsäurestoffwechsel, Adipogenese) als die am stärksten veränderten Wege in PIK3CAH1047R im Vergleich zu den Elternzellen (Supplementary Tabelle S4).Darüber hinaus wurden RNA-Bindung, RNA-Verarbeitung und mRNA-Spleißen auch von GSEA in der Reactome-Datenbank als signifikant angereicherte Wege in Mutanten im Vergleich zu Elternzellen sowie als Reaktion auf die PI3Kα-Hemmung als negativ angereichert identifiziert (Abb. 1C; ergänzende Abb. S1H; Ergänzungstabelle S4), was darauf hindeutet, dass das RNA-Spleißen ein wichtiger Effektorweg nach dem onkogenen PI3K sein könnte.Um das durch die PI3K-Aktivierung regulierte Netzwerk von Transkriptionsfaktoren (TF) zu definieren, führten wir TF-Motivanalysen in unseren Modellen durch.Wir identifizierten die AKT-Substrate FOXO (22), NRF1 (23) und AR (24) sowie E2F-Proteine ​​(25), MYC (26), ELK1 (27), STAT5 (28), TCF4 (27), von denen zuvor beschrieben wurde, dass sie durch den PI3K-Signalweg reguliert werden.Unsere Analysen sagten auch eine Reihe von TFs wie PR, GR, RORA, YY1, AP1 (Ergänzungstabelle S4) voraus, über deren Regulierung über den PI3K-Weg zuvor nicht berichtet worden war.Um die Relevanz dieser TFs bei der Modulation von Transkriptionsausgaben weiter zu definieren, haben wir die Chromatinlandschaft von mutierten und elterlichen MCF10A-Zellen unter Verwendung der ATAC-seq abgefragt.Weit verbreitete (n = 8.330) Änderungen der Chromatinzugänglichkeit wurden durch mutierte PI3K im Vergleich zu Elternzellen vermittelt (ergänzende Abb. S1I).In Übereinstimmung mit unseren RNA-seq-TF-Aktivitätsanalysen identifizierte die De-novo-Motivanalyse AP1, ZEB1, YY2, Kernrezeptor, ELK, TCF und STAT unter den wichtigsten TFs-Motiven, die bei Aktivierung des PI3K-Signalwegs angereichert wurden (ergänzende Abb. S1J).Insgesamt identifizierten unsere integrierten RNA-seq- und ATAC-seq-Analysen einen robusten Satz von TFs, deren Funktion möglicherweise durch die Aktivierung des PI3K-Signalwegs reguliert wird.Frühere Studien haben den PI3K/AKT/mTOR-Weg mit spezifischen Komponenten der Spleißmaschinerie in Verbindung gebracht (11–17).Es wurde jedoch nicht über eine systematische Untersuchung des Spleißens bei Aktivierung und Hemmung des PI3K-Signalwegs durch RNA-seq berichtet.Zu diesem Zweck führten wir zunächst eine RNA-Splicing-Analyse zur differenziellen Verwendung bekannter Exons und Splice-Junctions unter Verwendung des JunctionSeq-Algorithmus (29) durch.Die Anzahl der identifizierten signifikant veränderten Ereignisse war in mutierten MCF10A-Zellen im Vergleich zu Elternzellen (n = 4.444) und auch im Vergleich zu mit PI3Kα-Inhibitor behandelten mutierten Zellen (n = 1.539) größer.Die gleiche Analyse in MEF-Zellen identifizierte auch weit verbreitete RNA-Splicing-Veränderungen, die durch die PIK3CAH1047R-Mutation (n = 2092) und durch die PI3Kα-Hemmung (n = 735; Ergänzungstabelle S5) vermittelt wurden.Obwohl bekannt ist, dass alternatives Spleißen gewebe- und artspezifisch ist (30), identifizierte die Überschneidung unterschiedlich falsch gespleißter Gene in unseren Human- und Mausmodellen Ereignisse in 6 Genen, nämlich CCDN3, CKAP4, YPEL, RPL27, COG5 und IP6K2.Die umgekehrte Korrelation signifikanter Ereignisse zwischen Mutantenzellen gegenüber Eltern- und Mutantenzellen gegenüber PI3K-Hemmung lieferte den Beweis, dass die Behandlung mit PI3Kα-Inhibitoren RNA-Splicing-Ereignisse sowohl in MEF- als auch in MCF10A-Linien umkehren kann (Abb. 1D; ergänzende Abb. S1K).Wir haben einen zuverlässigen Satz von 618 Isoformen in MCF10A-Zellen und 283 Isoformen in MEFs etabliert, die statistisch signifikante alternative Spleißereignisse hervorriefen, die zwischen PIK3CAH1047R und Elternzellen umgekehrt korrelierten und auch durch PI3Kα-Hemmung gerettet wurden (Abb. 1D und E; ergänzende Abb. S1L). .Die Annotation dieser Splicing-Ereignisse ergab, dass die häufigsten Änderungen der Isoform-Ebene Exon-Skipping von einzelnen und mehreren Exons und alternative Terminierungs- und Startstellen der Transkription waren (Abb. 1F; ergänzende Abb. S1M; ergänzende Tabelle S5).Eine Analyse der Genontologie (GO) der 618 Isoformen in MCF10A identifizierte die Anreicherung mehrerer biologischer Wege, darunter: Translation, RNA-katabolischer Prozess, mRNA- und Peptidstoffwechselprozess, Ribosomenbiogenese und Zellzyklus (Ergänzungstabelle S6).Neben JunctionSeq (29) haben wir auch zuverlässig das RNA-Spleißen und Änderungen der Verwendung von Isoformen mit den etablierten Algorithmen IsoformSwitchAnalyzerR (31), rMATS (32) und SUPPA2 (33) bewertet.Für Spleißvalidierungen haben wir die signifikantesten Kandidaten ausgewählt, die von mindestens zwei Algorithmen erkannt wurden, wobei für jeden Algorithmus dasselbe Spleißereignis durch PI3Kα-Hemmung rückgängig gemacht wurde.Unter den 71 Genen, die durch mindestens zwei Algorithmen signifikant gespleißt wurden (Ergänzungstabelle S7), wurden 10 Kandidaten mit Genfunktionen, die an Spleißen, Migration, Zellwachstum und Stoffwechsel beteiligt sind, zufällig ausgewählt und validiert: ​​AFMID, kodierend für Arylformamidase, beteiligt an Abbau von Tryptophan;CCND3, das das den Zellzyklus fördernde Cyclin D3 codiert;HNRNPC, das für das heterogene nukleare Ribonukleoprotein C des Spleißfaktors kodiert;IP6K2, das die Inositolhexaphosphatkinase 2 kodiert;MTUS1, das für das Mikrotubuli-assoziierte Gerüstprotein 1 kodiert;PTK2/FAK, kodierend für die fokale Adhäsionskinase;SRP68, das das Signal Recognition Particle 68 codiert;SPRK2, das für den Spleißfaktor SRSF-Kinase 2 kodiert;RRAS2, Codierung des Signalwandlers RAS bezogen auf 2;und UNKL, das für eine mutmaßliche E3-Ubiquitin-Ligase Unk wie Zinkfinger kodiert (Fig. 1G).Als nächstes validierten wir Spleißereignisse innerhalb der 10 Kandidaten in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen mit oder ohne Behandlung mit Alpelisib.Wir beobachteten eine Verarmung der gespleißten Regionen von AFMID, CCND3, MTUS1, SRP68, RRAS2, UNKL, PTK2/FAK und SRPK2 sowie eine Anreicherung der gespleißten Regionen von HNRNPC- und IP6K2-Isoformen in mutierten Zellen im Vergleich zu Elternzellen, das wurden durch PI3K-Hemmung umgekehrt, was mit unseren Computeranalysen übereinstimmte (Abb. 1G und 2A).Als Kontrolle blieben die Mengen ausgewählter ungespleißter Regionen für jedes Transkript konstant.Als nächstes untersuchten wir die alternativen Spleißereignisse in MCF7 (PIK3CAE545K), MDA-MB-453 (PIK3CAH1047R) und T47D (PIK3CAH1047R) und in vivo unter Verwendung von MCF7- und T47D-abgeleiteten Xenotransplantaten und einem PIK3CAH1047R-Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX)-Modell, das damit behandelt wurde Alpelisib oder Vehikel täglich für mehr als 15 Tage (ergänzende Abb. S2A und S2B).In drei PIK3CA-mutierten Brustkrebszelllinien wurden die alternativen Spleißereignisse von AFMID, CCND3, HNRNPC, PTK2, RRAS2, SRPK2 und UNKL bei der Behandlung mit Alpelisib in mindestens zwei Modellen gerettet (Abb. 2B; ergänzende Abb. S2C).Eine In-vivo-Validierung der Kandidaten-Spleißmuster in MCF7- oder T47D-abgeleiteten Xenograft-Tumoren und in den PDX-Modellen zeigte, dass die nachfolgenden Spleißveränderungen einer Reihe von Kandidaten auch in mindestens zwei Modellen nach Alpelisib-Behandlung beobachtet wurden (ergänzende Abb. S2B und S2C).Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass der PI3K-Signalweg ein entscheidender Regulator des RNA-Spleißens ist.PIK3CA-abhängiges alternatives RNA-Spleißen und Rekrutierung von RBPs in mehreren Brustmodellen.A, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 10 verschiedenen Genen in MCF10A-Zellen beobachtet wurden.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden 4 Stunden lang entweder mit DMSO oder Alpelisib (1 μmol/l) in Hungermedien behandelt.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer nicht gespleißten Region als Kontrolle übereinstimmen.Die Expressionsniveaus wurden auf Aktin normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.B, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 8 verschiedenen Genen in MCF7- oder MDA-MB-453-Brustkrebszellen beobachtet wurden.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer nicht gespleißten Region als Kontrolle übereinstimmen.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.C, MCF10A-Eltern- und Mutantenzellen wurden entweder mit DMSO als Kontrolle oder mit Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077 (100 nmol/l), GDC0068/ipatasertib (1 μmol/l) oder behandelt RAD001/Everolimus (100 nmol/L) unter Hungerbedingungen für 4 Stunden.RT-qPCR wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die zur Erkennung von PTK2/FAK- und AFMID-Splicing-Ereignissen und Primern, die mit einer ungespleißten Region übereinstimmen, als Kontrolle verwendet wurden.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.D, Motivanalyse der oberen angereicherten RBPs in den alternativ gespleißten Regionen der validierten Kandidaten in A. E, MCF10A PIK3CAH1047R-Zellen wurden 72 Stunden lang mit siRNA transfiziert, die auf die RBPs abzielt, und dann mit Alpelisib (1 μmol/L) in Hunger behandelt Medien für 4 Stunden.RT-qPCR für die angegebenen Gene wurde wie in A und C durchgeführt. Kreise, unabhängige Experimente.Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Proben zu vergleichen.*, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001;****, P < 0,0001;ns, nicht signifikant.PIK3CA-abhängiges alternatives RNA-Spleißen und Rekrutierung von RBPs in mehreren Brustmodellen.A, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 10 verschiedenen Genen in MCF10A-Zellen beobachtet wurden.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden 4 Stunden lang entweder mit DMSO oder Alpelisib (1 μmol/l) in Hungermedien behandelt.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer nicht gespleißten Region als Kontrolle übereinstimmen.Die Expressionsniveaus wurden auf Aktin normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.B, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 8 verschiedenen Genen in MCF7- oder MDA-MB-453-Brustkrebszellen beobachtet wurden.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer nicht gespleißten Region als Kontrolle übereinstimmen.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.C, MCF10A-Eltern- und Mutantenzellen wurden entweder mit DMSO als Kontrolle oder mit Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077 (100 nmol/l), GDC0068/ipatasertib (1 μmol/l) oder behandelt RAD001/Everolimus (100 nmol/L) unter Hungerbedingungen für 4 Stunden.RT-qPCR wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die zur Erkennung von PTK2/FAK- und AFMID-Splicing-Ereignissen und Primern, die mit einer ungespleißten Region übereinstimmen, als Kontrolle verwendet wurden.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.D, Motivanalyse der oberen angereicherten RBPs in den alternativ gespleißten Regionen der validierten Kandidaten in A. E, MCF10A PIK3CAH1047R-Zellen wurden 72 Stunden lang mit siRNA transfiziert, die auf die RBPs abzielt, und dann mit Alpelisib (1 μmol/L) in Hunger behandelt Medien für 4 Stunden.RT-qPCR für die angegebenen Gene wurde wie in A und C durchgeführt. Kreise, unabhängige Experimente.Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Proben zu vergleichen.*, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001;****, P < 0,0001;ns, nicht signifikant.Um die Komponente des PI3K-Signalwegs herauszufiltern, die für die validierten Spleißveränderungen verantwortlich ist, behandelten wir elterliche und PIK3CAH1047R-mutierte MCF10A-Zellen mit einer Reihe von Inhibitoren, die auf PI3K, AKT oder mTORC1 abzielen.Interessanterweise wurde das Spleißen von PTK2/FAK, AFMID, CCND3 und RRAS2 nicht durch mTORC1-Hemmung gerettet;SRPK2- und IP6K2-Spleißen wurden jedoch von allen getesteten PI3K/AKT/mTORC1-Inhibitoren gerettet (Abb. 2C; ergänzende Abb. S2D).Dies deutet auf eine genspezifische Regulation des RNA-Spleißens durch verschiedene Mitglieder der PI3K/AKT/mTORC1-Signalkaskade hin.Um die spleißosomalen Faktoren zu untersuchen, die für die beobachteten Spleißveränderungen aufgrund von PIK3CA-aktivierenden Mutationen verantwortlich sind, führten wir eine RNA-bindende Protein (RBP)-Motivanalyse der alternativ gespleißten Regionen durch, die über verschiedene Brustmodelle hinweg unter Verwendung von RBP-map validiert wurde (34).Motive innerhalb der SRSF-Familie (SRSF1, SRSF2, SRSF3, SRSF7, TRA2B/SRSF10) CELF1, HNRNPC und der Splicing-Repressor PTBP1 (Abb. 2D; ergänzende Abb. S3A; ergänzende Tabellen S8 und S9) wurden signifikant angereichert (P-Wert < 0,05) an den ausgewählten oberen PI3K-abhängigen Spleißstellen.Um die RBPs zu identifizieren, die für das RNA-Spleißen der ausgewählten Kandidaten verantwortlich sind, wurden MCF10A-PIK3CAH1047R-Zellen mit siRNA transfiziert, die auf die in der Motivanalyse gefundenen RBPs abzielt, und 72 Stunden später 4 Stunden lang mit Alpelisib behandelt.Die effektive Herunterregulierung jedes RBP wurde mittels qRT-PCR überprüft (ergänzende Abb. S3B).Wir haben nur die RBPs berücksichtigt, deren Knockdown die Spleißänderungen des getesteten Kandidaten (PTK2, AFMID, SRPK2, RRAS2, HNRNPC, IP6K2) rückgängig gemacht hat, ohne die Stabilität jedes Transkripts als Validierung wesentlich zu beeinträchtigen.Gemäß diesen Kriterien schien die Mehrheit der Splicing-Ereignisse von Mitgliedern der SRSF-Familie co-reguliert zu sein, während der Knockdown von PTBP1 die Stabilität aller getesteten Gene deutlich verringerte.(Abb. 2E; Ergänzende Abb. S4).Obwohl sowohl PTK2/FRNK als auch AFMID von AKT und nicht von mTOR reguliert zu werden schienen (Abb. 2C), wurde das Spleißen von FRNK interessanterweise von SRSF3, aber nicht von SRSF7 reguliert, während das Spleißen von AFMID von SRSF7, aber nicht von SRSF3 reguliert wurde, was auf eine Gen- spezifische Modulation des Spleißens durch AKT.Um die möglichen funktionellen Konsequenzen der durch den PI3K-Signalweg modulierten differentiellen Splicing-Ereignisse zu veranschaulichen, konzentrierten wir uns auf zwei Kandidaten, die in präklinischen Modellen und in Patientenproben validiert wurden.Ihr alternatives Spleißen wurde zuvor berichtet, wenn auch nicht in einer PI3K-abhängigen Weise.PTK2 oder fokale Adhäsionskinase FAK ist eine intrazelluläre Proteintyrosinkinase, die an Zellmotilität, Invasion, Überleben, Proliferation und Epithel-Mesenchym-Übergang beteiligt ist (35).AFMID ist eine Arylformamidase, die entscheidend für den Stoffwechselweg des Tryptophans und die Biogenese der Kofaktoren Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) ist (36, 37).Eine detaillierte Analyse der PTK2/FAK-Transkripte ergab, dass eine intronische Region des kanonischen PTK2-240-Transkripts in PIK3CAH1047R, aber nicht in Elternzellen, signifikant ausgeschlossen und durch Alpelisib-Behandlung rückgängig gemacht wurde (Abb. 3A).Dieses Ereignis kann als alternative Transkriptionsstartstelle (ATSS) oder als Intronretention annotiert werden, um das kurze Transkript PTK2–203 zu produzieren.PTK2–203-Verlust wurde in PIK3CAH1047R-Zellen validiert und umgekehrt wurde ein anschließender Gewinn während der PI3K- oder AKT-Hemmung beobachtet (Abb. 2A und C).Das Transkript PTK2–203 codiert eine bekannte Proteinisoform namens FRNK, einen dominanten negativen Regulator von PTK2/FAK selbst (38, 39).Während FERM- und Kinase-Domänen fehlen, behält FRNK seine FAT-Domäne (Fig. 3B) und somit die Fähigkeit, sich an fokalen Adhäsionsplaques zu lokalisieren.Diese Lokalisierung wird benötigt, um mit PTK2/FAK-Bindungspartnern zu interagieren und unterbricht somit die PTK2/FAK-Aktivierung (40).Funktionelle Bewertung mutanter PIK3CA-regulierter gespleißter Isoformen.A, Schema des PTK2/FAK-Lokus, das die exprimierten Isoformen zeigt, mit Vergrößerung von PTK2–203 (FRNK).Oben, Coverage Tracks Plot Expression Levels in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen, die mit DMSO oder Alpelisib behandelt wurden.Unten zeigen Spuren Spleißstellen und Pfeile entsprechen verankerten Stellen von Primern, die für den RT-qPCR-Nachweis verwendet werden.B, In-silico-Übersetzung von PTK2/FAK-Transkripten.Schematische Darstellung der Proteindomänen von PTK2/FAK-Hauptisoform und FRNK.PTK2/FAK enthält eine FERM-Domäne, eine Kinase-Domäne und eine FAT-Domäne.FRNK fehlen die FERM- und Kinasedomänen.C, Western-Blot-Analysen der PTK2/FAK- und FRNK-Expressionsniveaus in MCF10A-Zellen, die mit verschiedenen Inhibitoren behandelt wurden.Elterliche und mutierte MCF10A-Zellen wurden entweder mit DMSO als Kontrolle oder mit Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077/inavolisib (100 nmol/l), Ipatasertib (1 μmol/l) oder Everolimus ( 100 nmol/L) unter Hungerbedingungen für 24 Stunden.Die Spiegel von phosphoryliertem AKT (pAKT) und phosphoryliertem S6 (pS6) wurden verwendet, um die Wirksamkeit jedes Inhibitors zu überwachen.Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet.D, MCF10A-Mutantenzellen wurden mit dem Tet-FRNK-EGFP-Konstrukt transduziert und anschließend selektiert, um eine stabile Zelllinie (MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP) zu erhalten.Quantifizierung des Wundheilungsassays, der unter Verwendung der stabilen Zelllinie MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP unter Hungerbedingungen nach vorheriger Induktion der FRNK-EGFP-Expression durch Doxycyclin (+DOX, 1 mg/ml) durchgeführt wurde.E, Wachstumskurven der stabilen Zelllinie MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP in Voll- oder Doxycyclin-enthaltendem Medium (1 mg/ml).Die Zellzahlen wurden alle 24 Stunden in drei unabhängigen Kulturen für 7 Tage gemessen.Fehlerbalken, SD.F, Schema des AFMID-Locus, das die exprimierten Isoformen zeigt, mit Vergrößerung von AFMID-202.Oben, Coverage Tracks Plot Expression Levels in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen, die mit DMSO oder Alpelisib behandelt wurden.Unten zeigen Spuren Spleißstellen und Pfeile entsprechen verankerten Stellen von Primern, die für den RT-qPCR-Nachweis verwendet werden.G,In-silico-Übersetzung von AFMID-Transkripten.Rote, alternativ gespleißte Kassette (Exon 5–9), die das AFMID-202 definiert.Das graue Kästchen mit gestrichelten Linien zeigt die Region der KFase-Domäne an, in die diese Kassette transkribiert wird, wobei ihr Bereich in roten Buchstaben angegeben ist.Die katalytische Triade aus S164-, D247- und H279-Resten, entscheidend für die KFase-Aktivität, ist blau hervorgehoben.H, Wachstumskurven der stabilen Zelllinie MCF7 pIND20 AFMID-202 in Voll- oder Doxycyclin-enthaltendem Medium (1 mg/ml).Zellzahlen wurden alle 24 Stunden in drei unabhängigen Kulturen für 0, 2, 4 und 6 Tage gemessen.Fehlerbalken, SD.I, Dosis-Wirkungs-Kurven von MCF7 und T47D, behandelt mit steigenden Dosen von H3B-8800, zusammen mit Alpelisib.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen/Bedingung.*, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001 (einseitiger ungepaarter t-Test).Funktionelle Bewertung mutanter PIK3CA-regulierter gespleißter Isoformen.A, Schema des PTK2/FAK-Lokus, das die exprimierten Isoformen zeigt, mit Vergrößerung von PTK2–203 (FRNK).Oben, Coverage Tracks Plot Expression Levels in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen, die mit DMSO oder Alpelisib behandelt wurden.Unten zeigen Spuren Spleißstellen und Pfeile entsprechen verankerten Stellen von Primern, die für den RT-qPCR-Nachweis verwendet werden.B, In-silico-Übersetzung von PTK2/FAK-Transkripten.Schematische Darstellung der Proteindomänen von PTK2/FAK-Hauptisoform und FRNK.PTK2/FAK enthält eine FERM-Domäne, eine Kinase-Domäne und eine FAT-Domäne.FRNK fehlen die FERM- und Kinasedomänen.C, Western-Blot-Analysen der PTK2/FAK- und FRNK-Expressionsniveaus in MCF10A-Zellen, die mit verschiedenen Inhibitoren behandelt wurden.Elterliche und mutierte MCF10A-Zellen wurden entweder mit DMSO als Kontrolle oder mit Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077/inavolisib (100 nmol/l), Ipatasertib (1 μmol/l) oder Everolimus ( 100 nmol/L) unter Hungerbedingungen für 24 Stunden.Die Spiegel von phosphoryliertem AKT (pAKT) und phosphoryliertem S6 (pS6) wurden verwendet, um die Wirksamkeit jedes Inhibitors zu überwachen.Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet.D, MCF10A-Mutantenzellen wurden mit dem Tet-FRNK-EGFP-Konstrukt transduziert und anschließend selektiert, um eine stabile Zelllinie (MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP) zu erhalten.Quantifizierung des Wundheilungsassays, der unter Verwendung der stabilen Zelllinie MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP unter Hungerbedingungen nach vorheriger Induktion der FRNK-EGFP-Expression durch Doxycyclin (+DOX, 1 mg/ml) durchgeführt wurde.E, Wachstumskurven der stabilen Zelllinie MCF10A PIK3CAH1047R Tet-FRNK-EGFP in Voll- oder Doxycyclin-enthaltendem Medium (1 mg/ml).Die Zellzahlen wurden alle 24 Stunden in drei unabhängigen Kulturen für 7 Tage gemessen.Fehlerbalken, SD.F, Schema des AFMID-Locus, das die exprimierten Isoformen zeigt, mit Vergrößerung von AFMID-202.Oben, Coverage Tracks Plot Expression Levels in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen, die mit DMSO oder Alpelisib behandelt wurden.Unten zeigen Spuren Spleißstellen und Pfeile entsprechen verankerten Stellen von Primern, die für den RT-qPCR-Nachweis verwendet werden.G,In-silico-Übersetzung von AFMID-Transkripten.Rote, alternativ gespleißte Kassette (Exon 5–9), die das AFMID-202 definiert.Das graue Kästchen mit gestrichelten Linien zeigt die Region der KFase-Domäne an, in die diese Kassette transkribiert wird, wobei ihr Bereich in roten Buchstaben angegeben ist.Die katalytische Triade aus S164-, D247- und H279-Resten, entscheidend für die KFase-Aktivität, ist blau hervorgehoben.H, Wachstumskurven der stabilen Zelllinie MCF7 pIND20 AFMID-202 in Voll- oder Doxycyclin-enthaltendem Medium (1 mg/ml).Zellzahlen wurden alle 24 Stunden in drei unabhängigen Kulturen für 0, 2, 4 und 6 Tage gemessen.Fehlerbalken, SD.I, Dosis-Wirkungs-Kurven von MCF7 und T47D, behandelt mit steigenden Dosen von H3B-8800, zusammen mit Alpelisib.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen/Bedingung.*, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001 (einseitiger ungepaarter t-Test).Die Expression sowohl der PTK2/FAK- als auch der FRNK-Isoformen wurde durch Western Blot in Eltern- und PIK3CAH1047R-MCF10A-Zellen untersucht, die mit einer Reihe von Inhibitoren des PI3K-Signalwegs behandelt wurden ( 3C ).Die FRNK-Isoform wird in PIK3CAH1047R-Zellen im Vergleich zu Elternzellen ablatiert, aber durch verschiedene PI3Ka-Inhibitoren (Alpelisib, GDC0077 und Taselisib) und den AKT-Inhibitor Ipatasertib induziert, nicht jedoch durch den mTORC1-Inhibitor Everolimus (Abb. 3C).Aus diesem Grund haben wir eine Doxycyclin-induzierbare FRNK in mutierten MCF10A-Zellen stabil transduziert, um ihre Zellmigration und -proliferation in Abwesenheit oder in Anwesenheit von FRNK zu untersuchen.Infolgedessen führte die Behandlung mit Alpelisib oder die Überexpression eines induzierbaren FRNK mit GFP-Tag zu einer verringerten Zellmigration mutierter MCF10A-Zellen, wie durch einen Wundheilungstest (Abb. 3D; ergänzende Abb. S5A–S5D) und Zellproliferation (Abb. 3E) getestet ).Bemerkenswerterweise wurde pAKT durch FRNK-Überexpression reduziert, in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen, die zeigen, dass PTK2/FAK den PI3K-Weg durch Phosphorylierung der regulatorischen Untereinheit p85 aktiviert ( 3C ; Ref. 41).Diese Daten zeigten, dass die PI3K/AKT-Aktivierung die negative Regulation von PTK2 über die Regulation des alternativen RNA-Spleißens und des Wechsels der FRNK-Isoform aufhob und somit die PTK2-vermittelte nachgeschaltete Signalübertragung freisetzte.Dementsprechend stellte die Behandlung mit PI3K/AKT-Inhibitoren FRNK wieder her, was die PTK2-Funktion bei Zellwachstum und -migration abschwächte.Die Analyse des AFMID-Locus ergab, dass die Exons 5–9, die zum AFMID-202-Transkript gehören, in MCF10A-Mutantenzellen ausgeschlossen, aber bei der Behandlung mit Alpelisib signifikant eingeschlossen wurden (Abb. 3F).AFMID-202 wird in das Hauptproteinprodukt (Isoform a, 303 aa) translatiert, nach dem korrekten Einschluss von Exon 5–9 (Abb. 3G; Lit. 42).Interessanterweise kodiert diese alternative gespleißte Kassette für die Kynurenin-Formamidase (KFase)-Domäne, die ein HGGWX-Motiv (Exon 5), eine Alpha/Beta-Hydrolase-Domäne (Exons 4–9) und die katalytisch aktiven Reste S162, D247 und H279 enthält, die für diese entscheidend sind die katalytische Aktivität von AFMID (Fig. 3G; Lit. 43).Angesichts der Tatsache, dass die Kynurenin-Akkumulation die Zellproliferation hemmt (44), stellten wir die Hypothese auf, dass der Einschluss der Exon 5–9-Spleißkassette in die reife AFMID-202-mRNA nach der PI3Kα-Hemmung die Zellproliferation von PIK3CA-mutierten Zelllinien beeinflussen würde.Wir transduzierten MCF10A PIK3CAH1047R-, MCF7- und T47D-Zellen mit einem induzierbaren AFMID-202-Vektor (Abb. 3H; ergänzende Abb. S5E und S5F) und beobachteten eine reduzierte Zellproliferation bei Überexpression von AFMID-202.Darüber hinaus rettet nach der Alpelisib-Behandlung die AFMID-Depletion durch einen Pool von siRNAs in mutierten MCF10A-Zellen die durch Alpelisib induzierte Proliferationshemmung erheblich (ergänzende Abb. S5G und S5H).Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass der PI3K-Weg alternatives Spleißen verwendet, um den Wechsel zu onkogenen RNA-Isoformen zu fördern, die das Wachstum, die Migration und den Stoffwechsel bei Brustkrebs steuern, und dass diese Veränderungen durch die Behandlung mit PI3K-Inhibitoren teilweise rückgängig gemacht werden können.Angesichts der Tatsache, dass die PI3K-regulierten alternativ gespleißten Isoformen die Zellproliferation von PIK3CA-mutierten Brustkrebszellen beeinflussen, fragten wir uns, ob Spleißosomen-Inhibitoren, die sich derzeit in klinischen Studien befinden, H3B-8800 (NCT02841540) Inhibitor des SF3b-Komplexes (45) oder der Splicing-Inhibitor E7070 ( NCT00165880), das auf den Prä-mRNA-Spleißfaktor RBM39 (46) abzielt, würde Brustkrebszellen für Alpelisib sensibilisieren.Interessanterweise erhöhten Spleißmodulatoren die Empfindlichkeit von MCF7- und T47D-Zellen gegenüber Alpelisib (Abb. 3I; ergänzende Abb. S5I), was eine Begründung für eine auf das Spleißosom gerichtete Therapie in Kombination mit Alpelisib bei ER+-Brustkrebs liefert.Um unsere Ergebnisse im klinischen Umfeld zu erweitern, führten wir RNA-seq (100–150 Millionen Reads) in 8 Tumorproben durch, die von Patienten mit Brustkrebs mit PIK3CA-Mutation isoliert wurden, die in eine klinische Phase-I-Studie mit dem PI3Kα-Inhibitor GDC0077 (Inavolisib) aufgenommen wurden. .Darüber hinaus analysierten wir RNA-seq-Daten von 10 Tumoren, die von mit Alpelisib behandelten Brustkrebspatientinnen isoliert wurden (47).Vor der Therapie mit dem PI3Kα-Inhibitor und nach 14 Tagen täglicher Behandlung, 2 bis 4 Stunden nach der Arzneimittelverabreichung, wurden gepaarte longitudinale Tumorbiopsien entnommen ( 4A ).Eine differenzielle Genexpressions-Heatmap von mit PI3K-Mutanten und PI3Kα-Inhibitoren behandelten Patientenbiopsien zeigte eine Trennung von Brustkrebs vor und während der Behandlung (n = 4967, FDR-bereinigter P-Wert < 0,05; Abb. 4B; Ergänzungstabelle S10).Die GSEA-Analyse identifizierte Stoffwechselwege wie den Fettsäurestoffwechsel, die Adipogenese und die Cholesterinhomöostase als die wichtigsten Stoffwechselwege, die in Proben angereichert sind, die einer akuten pharmakologischen PI3K-Hemmung unterzogen wurden (Ergänzungstabelle S11).Konvergente Wirkungen von mutiertem PIK3CA auf die Regulierung des RNA-Spleißens bei Patienten mit Brustkrebs.A, Grafische Zusammenfassung der Brustkrebspatientenkohorte, die mit PI3Kα-Inhibitoren behandelt wurde.Paarweise Tumorbiopsien wurden vor der PI3Kα-Inhibitortherapie und nach 14 Tagen täglicher Behandlung, 2 bis 4 Stunden nach der Arzneimittelverabreichung, von verfügbaren primären oder metastatischen Stellen erhalten.Der Einfachheit halber sind die Leber- und primäre Brustbiopsie gezeigt.Erstellt mit BioRender.com.B, Heatmap, die alle signifikant differentiell exprimierten Gene (q < 0,05) und nach GDC0077-Behandlung bei 8 Tumoren von Brustkrebspatientinnen mit PIK3CA-Mutation zeigt.C, Splicing-Ereignisse-MA-Plot, der die normalisierte Expression und die log2-fache Änderung von PIK3CA-Mutantenproben vor der Behandlung mit dem PI3Kα-Inhibitor und während der Behandlung mit GDC0077 vergleicht.Die verwendeten Vor- und Nachbehandlungsproben sind PT1, PT2, PT3, PT8, Vorprobe PT6 und Nachprobe PT7.D, Kreisdiagramm, das den Prozentsatz jeder Art von Spleißereignis zeigt, kommentiert wie in Fig. 1F, in denselben Tumorproben wie in Fig. 2C.E, GDC0077 Anreicherung der Kandidaten-Isoform GO vor und während der Behandlung in Reactome-Signaturen.F, Volcano-Plot, der die log2-fache Änderung der Isoform-Expression während der Behandlung gegenüber der Isoform-Expression vor der Behandlung auf der x-Achse und den –log10-bereinigten P-Wert auf der y-Achse zeigt.Rote Punkte, signifikant differentiell exprimierte Isoformen;graue Punkte, Isoformen, die sich im Ausdruck nicht signifikant unterscheiden.Schwarze Kreise sind die 4.309 alternativ gespleißten Isoformen.Die schwarz markierten Isoformen zeigen die signifikanteste Isoform pro Gen, die GDC0077/Inavolisib- und MCF10A-Isoform-Kandidaten gemeinsam haben.Die grau markierten stellen einige Top-Isoformen dar, die für GDC0077/Inavolisib spezifisch sind.Die mit dem Pfeil gekennzeichneten Isoformen umfassen validierte Kandidaten in diesem Bericht.G, RBP-Motive, die in MCF10A-Linien validiert wurden, weisen ebenfalls eine signifikante Anreicherung innerhalb der Exons von alternativ gespleißten Isoformen der GDC0077/Inavolisib-Kohorte auf.Jeder Punkt zeigt ein AS-Exon innerhalb der GDC0077/Inavolisib-Kohorte an.Die x-Achse zeigt den –log10P-Wert eines Motivtreffers.Konvergente Wirkungen von mutiertem PIK3CA auf die Regulierung des RNA-Spleißens bei Patienten mit Brustkrebs.A, Grafische Zusammenfassung der Brustkrebspatientenkohorte, die mit PI3Kα-Inhibitoren behandelt wurde.Paarweise Tumorbiopsien wurden vor der PI3Kα-Inhibitortherapie und nach 14 Tagen täglicher Behandlung, 2 bis 4 Stunden nach der Arzneimittelverabreichung, von verfügbaren primären oder metastatischen Stellen erhalten.Der Einfachheit halber sind die Leber- und primäre Brustbiopsie gezeigt.Erstellt mit BioRender.com.B, Heatmap, die alle signifikant differentiell exprimierten Gene (q < 0,05) und nach GDC0077-Behandlung bei 8 Tumoren von Brustkrebspatientinnen mit PIK3CA-Mutation zeigt.C, Splicing-Ereignisse-MA-Plot, der die normalisierte Expression und die log2-fache Änderung von PIK3CA-Mutantenproben vor der Behandlung mit dem PI3Kα-Inhibitor und während der Behandlung mit GDC0077 vergleicht.Die verwendeten Vor- und Nachbehandlungsproben sind PT1, PT2, PT3, PT8, Vorprobe PT6 und Nachprobe PT7.D, Kreisdiagramm, das den Prozentsatz jeder Art von Spleißereignis zeigt, kommentiert wie in Fig. 1F, in denselben Tumorproben wie in Fig. 2C.E, GDC0077 Anreicherung der Kandidaten-Isoform GO vor und während der Behandlung in Reactome-Signaturen.F, Volcano-Plot, der die log2-fache Änderung der Isoform-Expression während der Behandlung gegenüber der Isoform-Expression vor der Behandlung auf der x-Achse und den –log10-bereinigten P-Wert auf der y-Achse zeigt.Rote Punkte, signifikant differentiell exprimierte Isoformen;graue Punkte, Isoformen, die sich im Ausdruck nicht signifikant unterscheiden.Schwarze Kreise sind die 4.309 alternativ gespleißten Isoformen.Die schwarz markierten Isoformen zeigen die signifikanteste Isoform pro Gen, die GDC0077/Inavolisib- und MCF10A-Isoform-Kandidaten gemeinsam haben.Die grau markierten stellen einige Top-Isoformen dar, die für GDC0077/Inavolisib spezifisch sind.Die mit dem Pfeil gekennzeichneten Isoformen umfassen validierte Kandidaten in diesem Bericht.G, RBP-Motive, die in MCF10A-Linien validiert wurden, weisen ebenfalls eine signifikante Anreicherung innerhalb der Exons von alternativ gespleißten Isoformen der GDC0077/Inavolisib-Kohorte auf.Jeder Punkt zeigt ein AS-Exon innerhalb der GDC0077/Inavolisib-Kohorte an.Die x-Achse zeigt den –log10P-Wert eines Motivtreffers.Die Anreicherung der GSEA-Motivsignatur ergab, dass TFs wie STATs, FOXOs, ETS, die nukleären Hormonrezeptoren PPARG, AR, ER, RORA, die TFs FOXA1 (HNF3ALPHA) und GATA unter anderem bei PI3Kα-Hemmung positiv angereichert werden (ergänzende Abb. S6A ).Bemerkenswert ist, dass die FOXO-TF-Familie ein gut etabliertes direktes Ziel des PI3K-Signalwegs ist, und wir beobachteten, dass ihre Aktivität und die Expression von FOXO-Zielgenen (unter anderem PDK4, IGF2, LIPG, INSR, CDKN3, APOC3) hochreguliert waren nach der Behandlung, im Einklang mit der Hemmung des Signalwegs (Ergänzungstabelle S10; Ergänzende Abb. S6A).Im Gegensatz dazu waren die TF-Motive von AP1, E2Fs, OCT und PAX während der Behandlung erschöpft (ergänzende Abb. S6A).Eine Untersuchung von TF-Motiven, die in ATAC-seq von zwei ER+-gepaarten Brustkrebsbiopsien identifiziert wurden, die vor und während der Behandlung mit Alpelisib entnommen worden waren (47), identifizierte auch responsive Elemente für ER, FOXA1, Kernrezeptor, STATs, AP1, GATA TF und andere (Ergänzungstabelle S12), was zusätzliche Beweise dafür liefert, dass die Aktivität dieser TFs möglicherweise durch den PI3K-Signalweg reguliert wird.Die Überlappung zwischen den in MEFs, MCF10A-Zellen und Proben von Brustkrebspatienten angereicherten TF-Motiven nach der Behandlung mit PI3Kα-Inhibitoren weist auf gemeinsame regulatorische Faktoren in allen 3 Systemen hin (ergänzende Abb. S6B).In der Brustkrebspatientenkohorte stellten wir fest, dass der onkogene PI3K-Weg > 4.000 alternative Spleißereignisse zwischen Proben vor und während der Behandlung förderte (Abb. 4C; Ergänzungstabelle S5).Dies übersetzte sich in die häufigsten Isoform-Änderungen als kombiniertes einzelnes und multiples Exon-Skipping, ATSS und alternative Transkriptionsterminationsstelle (ATTS) und in Übereinstimmung mit Zelllinien (Fig. 4D).Eine GO-Analyse der Gensignaturen der Isoform-Patientenkandidaten ergab eine Anreicherung des Fettsäure- und Kohlenhydratstoffwechsels (Abb. 4E; Ergänzungstabelle S13).SUPPA (33) wurde verwendet, um ein Profil für alle Splicing-Ereignisse oder Isoformen zu erstellen, die bei jedem Patientenpaar der GDC0077-Kohorte unterschiedlich exprimiert wurden.Diese Analysen ergaben, dass alternative Splicing-Ereignisse hauptsächlich für Alternative First (AF) und Exon-Skipping (ES; ergänzende Abb. S6C) angereichert wurden.Interessanterweise fanden wir in den Tumorproben von Patient 5 mit einer schwächeren und ungewöhnlichen PIK3CA-Mutation Q546K und Patient 8, der als PIK3CA-Wildtyp identifiziert wurde, wesentlich weniger signifikante alternative Ereignisse (ergänzende Abb. S6C).RNA-seq aus zehn Tumorbiopsien sowohl vor als auch während der Behandlung mit Alpelisib (47) enthielt dramatische Spleißveränderungen, die AF und ES als die beiden häufigsten Ereignisse begünstigten (ergänzende Abb. S6D).Wichtig ist, dass 21 der Kandidaten-Isoformen, die zuvor in MCF10A-Zellen identifiziert und in Brustkrebslinien und Xenotransplantaten validiert wurden, ähnliche RNA-Splicing-Muster in den gepoolten Patientenproben nach PI3K-Hemmung aufwiesen.Beispielsweise waren die Isoformen AFMID-202 und PTK2–203, die die Zellproliferation und -invasion negativ regulieren, in den Patientenkohorten, die mit GDC0077 (Abb. 4F) bzw Relevanz unserer präklinischen Zellliniendaten.Wir haben auch dieselben RBP-Motive, die in MCF10A-Linien validiert wurden, mit den Exons der alternativen Kandidaten in der GDC0077-Kohorte überlappt.Diese RBP-Analyse zeigte eine signifikante Anreicherung sowohl von SRSFs als auch von CELF1-Motiven innerhalb der Exons von alternativ gespleißten Isoformen der GDC0077 (Inavolisib)-Patientenkohorte (Abb. 4G).Diese Studie bietet eine umfassende transkriptomische Analyse des alternativen RNA-Spleißens, der Genexpression und der TF-Anreicherung nach Aktivierung und Hemmung des PI3K-Signalwegs in Zelllinien, Xenotransplantaten und Proben von Patienten mit Brustkrebs, die mit PI3Kα-Inhibitoren behandelt wurden.Wir entdeckten, dass der PI3K-Weg ein einzigartiges Transkriptom reguliert und alternatives Spleißen von Genen ermöglicht, die an Wachstum, Migration, Stoffwechsel und dem Spleißen selbst beteiligt sind.In präklinischen Modellen beobachteten wir gemeinsame TF-Motive, die bei Aktivierung und Hemmung des PI3K-Signalwegs umgekehrt angereichert wurden.Während erwartet wurde, dass einige dieser TFs mit dem PI3K-Signalweg assoziiert sind, identifizierten wir auch neue TFs wie PR, GR, RORA, ZEB1, AP1, YY1 und andere.Wichtig ist, dass eine beträchtliche Anzahl dieser TFs auch in den Analysen von Patientinnen mit Brustkrebs gefunden wurden, insbesondere in der Familie der nukleären Hormonrezeptoren.Zunehmende Beweise deuten auch darauf hin, dass Spleißveränderungen zur Tumorentstehung beitragen, und sie gelten heute als vollwertiges Kennzeichen von Krebs (8).Unsere umfassende Analyse des alternativen Spleißens bei der Modulation des PI3K-Signalwegs deckte weit verbreitete Spleissveränderungen von Isoformen auf, die am Stoffwechsel und Überleben der Zellen beteiligt sind, deren Fehlregulation zur Tumorgenese beitragen kann.Die gerettete Expression der Top-Spleißkandidaten PTK2 oder AFMID alternativ gespleißter Isoformen in Brustmodellen mit PI3K-Mutante führte zu einer beeinträchtigten Zellmigration und -proliferation.Dies legt nahe, dass der PI3K-Signalweg auch durch alternatives mRNA-Spleißen zur Tumorentstehung beitragen kann.Unsere Arbeit hebt eine weitere Ebene der Regulation des Stoffwechsels und der Proliferation durch den PI3K-Weg hervor, sowohl durch die Transkription von Stoffwechselfaktoren als auch durch das Spleißen von am Stoffwechsel beteiligten Genen, wie AFMID, in präklinischen Modellen und Patientenproben.Aberrantes Spleißen anderer am Zellwachstum beteiligter Kandidaten wie IP6K2, RRAS2/TC21 und CCND3 kann ebenfalls zur PI3K-abhängigen Tumorentstehung beitragen.Bemerkenswert ist, dass RRAS2/TC21 den PI3K-Weg aktiviert, der die Brusttumorgenese und die Brustdrüsenentwicklung in einer PI3K-abhängigen Weise fördert (48), und somit an einer Rückkopplungsschleife teilnimmt.Unsere unvoreingenommene Analyse zeigte die signifikante Anreicherung der RRAS-206-Isoform in präklinischen und klinischen Modellen nach PI3Kα-Hemmung.Es wird vorhergesagt, dass dieser Isoform die für die Stabilität und Funktion von RRAS2 entscheidenden GTP-Bindungs- und Schalterdomänen fehlen (49), wodurch ein zusätzlicher Weg identifiziert wird, über den das onkogene PI3K die Zellproliferation beeinflusst.Während unsere Arbeit darauf hindeutet, dass der PI3K-Weg auch durch alternatives mRNA-Spleißen zur Tumorentstehung beitragen kann, sprechen unsere Ergebnisse für eine systematische Untersuchung der biologischen Funktion der am besten modulierten Isoformen.Darüber hinaus deutet die Tatsache, dass Spleißmodulatoren Brustkrebszellen weiter für Alpelisib sensibilisieren, darauf hin, dass die PI3K-vermittelte Regulation des Spleißens potenziell therapeutisch nutzbar sein könnte.Ob PI3K-vermitteltes aberrantes RNA-Spleißen eine robuste Biomarker-gesteuerte transkriptomische Signatur der PI3K-Aktivierung und Reaktion auf PI3K-Inhibitoren vorhersagen kann, muss noch bestimmt werden.Interessanterweise vermittelt der PI3K-Weg das Spleißen von Genen, die für Mitglieder der Spleissmaschinerie selbst kodieren, wie SRPK2, HNRNPC, RBM5 und andere.Dies postuliert eine regulatorische Rückkopplungsschleife, wobei das PI3K-vermittelte Spleißen das Spleißen kontrolliert.Insbesondere entdeckten wir, dass das PI3Kα-abhängige alternative RNA-Spleißen von HNRNPC möglicherweise selbstreguliert ist und dies einen zusätzlichen Regulationsmodus bei der RNA-Verarbeitung bieten könnte, der durch den PI3K-Weg kontrolliert wird.Wir entdeckten auch eine robuste Signatur von RBPs, die das PI3K-abhängige RNA-Spleißen in Brustkrebszelllinien vermittelten.Insbesondere identifizierten wir mehrere Mitglieder der SRSF-Familie oder CELF1, um das PI3K-vermittelte Spleißen von Kandidaten wie PTK2, AFMID, HNRNPC, RRAS2 und IP6K2 zu regulieren.Es wurde gezeigt, dass SRSF-Proteine ​​(11–13) und CELF1 (50) durch direkte Phosphorylierung durch AKT reguliert werden können.Darüber hinaus interagiert AKT mit SRPKs, um Autophosphorylierung und Kerntranslokation zu induzieren, um SR-Proteine ​​zu aktivieren und alternatives Spleißen zu beeinflussen (17).Ein Bruchteil unserer validierten Kandidaten wurde durch PI3K- oder AKT-Inhibitoren gerettet, aber nicht durch den mTORC1-Inhibitor.Beispielsweise scheinen PTK2/FRNK- oder AFMID-Transkripte von AKT und nicht von mTOR reguliert zu werden, und das Spleißen von FRNK wird von SRSF3, aber nicht von SRSF7 reguliert, während das Spleißen von AFMID von SRSF7, aber nicht von SRSF3 reguliert wird.Diese Unterschiede können nicht nur durch die direkte oder indirekte Regulation von SR-Proteinen durch AKT erklärt werden, sondern legen eine genspezifische Modulation des alternativen Spleißens nahe, die für jeden der Kandidaten seziert werden muss.Daher sind weitere Arbeiten erforderlich, um die genauen Mechanismen zu bestimmen, wie der PI3K-Weg die RBP-Funktion beeinflusst, um das Spleißen jedes Kandidaten bei Brustkrebs zu regulieren.Bei Patientinnen mit Brustkrebs, die mit PI3Kα-Inhibitoren behandelt wurden, entdeckten wir mindestens 21 Gene wie IP6K2, UNKL, AFMID, KDM2B, NMT2, BCL6 und andere, die dieselbe Isoform aufwiesen, die alternativ in MCF10A-Zellen gespleißt war.Es bleibt zu klären, wie ausgeprägte Veränderungen in den Mitgliedern des PI3K-Signalwegs wie AKT- oder PIK3CA-Mutationen oder der Verlust von PTEN bei Brust- und anderen Malignomen zur Kontrolle der Genexpression und des RNA-Spleißens beitragen.Unsere Ergebnisse sprechen auch für eine systematische Untersuchung anderer häufig mutierter Onkoproteine, die das Spleißen verändern können, um die Tumorentstehung zu fördern.Es bleibt auch noch zu entdecken, ob Tumore, die vom onkogenen PI3K-Signalweg abhängig sind, möglicherweise empfindlicher auf Spleißosomen-Inhibitoren reagieren.Da alternatives Spleißen bekanntermaßen gewebespezifisch ist (30), sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Rollen dieser Spleißkandidaten in anderen zellulären Kontexten zu definieren.Insgesamt heben unsere Ergebnisse durch eine umfassende Transkriptomanalyse präklinischer und klinischer Modelle eine Schlüsselrolle des PI3K-Signalwegs bei der Regulierung des RNA-Spleißens hervor und decken neue Wechselwirkungen darüber auf, wie der PI3K die Proliferation und den Metabolismus bei Brustkrebs reguliert, was potenziell therapeutisch anvisiert werden kann Spleißosomen-Inhibitoren.F. Michelini meldet persönliche Gebühren von AstraZeneca außerhalb der eingereichten Arbeit.K. Jhaveri berichtet über weitere Unterstützung von Genentech, Novartis, Lilly Pharmaceuticals/Loxo Oncology, AstraZeneca, Pfizer, Zymeworks, Puma Biotechnology, Merck, Novita Pharmaceuticals, Debio Pharmaceuticals, ADC Therapeutics;persönliche Gebühren von Novartis, Pfizer, AstraZeneca, Lilly Pharmaceutical/Loxo Oncology, Daiichi Sankyo, Seattle Genetics, Taiho Oncology, Jounce Therapeutics, Blueprint Medicines;und persönliche Gebühren von Sun Pharma Advance Research Pvt.Ltd. außerhalb der eingereichten Arbeit.P. Castel meldet persönliche Honorare von Venthera außerhalb der eingereichten Arbeit.L. Fairchild berichtet, dass er derzeit Mitarbeiter bei Novartis Institutes of BioMedical Research ist, aber während der Mitarbeit am Manuskript mit MSKCC verbunden war.A. Arruabarrena-Aristorena berichtet über weitere Unterstützung durch ein Postdoktorandenstipendium der Bildungsabteilung der Regierung des Baskenlandes in Spanien während der Durchführung der Studie.M. Sallaku meldet persönliche Gebühren von Loxo Oncology während der Durchführung der Studie und persönliche Gebühren von Loxo Oncology außerhalb der eingereichten Arbeit.S. Chandarlapaty berichtet über Zuschüsse von BCRF, Daiichi-Sankyo und Zuschüsse von NIH/NCI während der Durchführung der Studie;Zuschüsse, persönliche Gebühren und nicht finanzielle Unterstützung von Novartis;persönliche Gebühren von Sanofi, Lilly, Inivata;Stipendien und persönliche Gebühren von Paige.ai, AstraZeneca;und Zuschüsse von Ambryx außerhalb der eingereichten Arbeit.O. Abdel-Wahab berichtet über Zuschüsse von Loxo Oncology, Lilly, H3 Biomedicine Inc., Nurix Therapeutics;andere Unterstützung von Aichemy Inc., Harmonic Discovery Inc.;und andere Unterstützung von Envisagenics Inc. außerhalb der eingereichten Arbeit.M. Scaltriti berichtet über andere Unterstützung von AstraZeneca und andere Unterstützung von AstraZeneca außerhalb der eingereichten Arbeit.E. Toska meldet Zuschüsse von Jayne Koskinas Ted Giovanis Grant, NIH K22CA245487, NIH R21CA252530, Breast Cancer Alliance, und Zuschüsse von Innovation to Cancer Informatics während der Durchführung der Studie;Stipendien und persönliche Gebühren von AstraZeneca außerhalb der eingereichten Arbeit.Von den anderen Autoren wurden keine Angaben gemacht.E. Ladewig: Konzeptualisierung, Datenkuratierung, Software, formale Analyse, Visualisierung, Methodik, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.F. Michelini: Konzeptualisierung, formale Analyse, Visualisierung, Methodik, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.K. Jhaveri: Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.P. Castel: Konzeptualisierung, Schreiben – Review und Redaktion.J. Carmona: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.L. Fairchild: Formale Analyse.AG Zuniga: Untersuchung.A. Arruabarrena-Aristorena: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.E. Cocco: Recherche, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.R. Blawski: Untersuchung, Visualisierung.S. Kittane: Untersuchung, Visualisierung.Y. Zhang: Untersuchung.M. Sallaku: Untersuchung.L. Baldino: Untersuchung.V. Hristidis: Untersuchung.S. Chandarlapaty: Konzeptualisierung.O. Abdel-Wahab: Konzeptualisierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.