Hinweis: Ergänzende Daten zu diesem Artikel sind bei Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/) verfügbar.E. Ladewig, F. Michelini und K. Jhaveri haben zu gleichen Teilen zu diesem Artikel beigetragen.Erik Ladewig, Flavia Michelini, Komal Jhaveri, Pau Castel, Javier Carmona, Lauren Fairchild, Adler G. Zuniga, Amaia Arruabarrena-Aristorena, Emiliano Cocco, Ryan Blawski, Srushti Kittane, Yuhan Zhang, Mirna Sallaku, Laura Baldino, Vasilis Hristidis, Sarat Chandarlapaty, Omar Abdel-Wahab, Christina Leslie, Maurizio Scaltriti, Eneda Toska;Die onkogene PI3K-induzierte transkriptomische Landschaft zeigt Schlüsselfunktionen beim Spleißen und der Regulation der Genexpression.Cancer Res 15. Juni 2022;82 (12): 2269–2280.https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-0446Der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Weg reguliert die Proliferation, das Überleben und den Metabolismus und wird häufig bei menschlichen Krebsarten aktiviert.Eine umfassende Aufklärung darüber, wie dieser Signalweg Transkriptions- und Kotranskriptionsprozesse steuert, könnte neue Einblicke in die Schlüsselfunktionen der PI3K-Signalübertragung bei Krebs liefern.Hier haben wir einen transkriptomischen Ansatz verfolgt, um die genomweite Genexpression und Änderungen der Aktivität von Transkriptionsfaktoren sowie das Spleißen und die Nutzungsdynamik von Isoformen stromabwärts von PI3K zu untersuchen.Diese Analysen deckten weit verbreitete alternativ gespleißte Isoformen auf, die mit Proliferation, Metabolismus und Spleißen in PIK3CA-mutierten Zellen verbunden sind, die durch Hemmung von PI3Kα umgekehrt wurden.Die Analyse von gepaarten Tumorbiopsien von Patientinnen mit PIK3CA-mutiertem Brustkrebs, die sich einer Behandlung mit PI3Kα-Inhibitoren unterziehen, identifizierte weit verbreitete Spleißveränderungen, die spezifische Isoformen gemeinsam mit den präklinischen Modellen betreffen, und diese Veränderungen, nämlich PTK2/FRNK- und AFMID-Isoformen, wurden als funktionelle Treiber validiert des Wachstums oder der Migration von Krebszellen.Mechanistisch vermittelten isoformspezifische Spleißfaktoren das PI3K-abhängige RNA-Spleißen.Die Behandlung mit Splicing-Inhibitoren machte Brustkrebszellen empfindlicher gegenüber dem PI3Kα-Inhibitor Alpelisib, was zu einer stärkeren Wachstumshemmung führte als Alpelisib allein.Diese Studie liefert die erste umfassende Analyse weit verbreiteter Spleißveränderungen, die durch onkogenes PI3K bei Brustkrebs verursacht werden.Der Atlas der PI3K-vermittelten Spleißprogramme legt eine Schlüsselrolle für den PI3K-Signalweg bei der Regulierung des Spleißens fest und eröffnet neue Wege zur Nutzung der PI3K-Signalübertragung als therapeutische Schwachstelle bei Brustkrebs.Die transkriptomische Analyse zeigt eine Schlüsselrolle des PI3K-Signalwegs bei der Regulierung des RNA-Spleißens und deckt neue Mechanismen auf, durch die PI3K die Proliferation und den Metabolismus bei Brustkrebs reguliert.Siehe den zugehörigen Kommentar von Claridge und Hopkins, S.2216Der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Signalweg steuert mehrere zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Proliferation, Metabolismus, Translation, Überleben und Apoptose.Eine aberrante Hyperaktivierung dieses Signalwegs nach Gain-of-Function-Mutationen in PIK3CA, dem Gen, das für die katalytische Untereinheit von PI3K (p110α) kodiert, trägt zu multiplen Entwicklungsstörungen, Krebs und Behandlungsresistenz bei verschiedenen Tumorarten bei.Mutationen in PIK3CA werden in bis zu 40 % der Östrogenrezeptor-positiven (ER+) HER2-negativen primären und metastasierten Brusttumoren gefunden (1–4), und die Kombination des PI3Kα-spezifischen Inhibitors Alpelisib mit dem ER-Degrader Fulvestrant ist von zugelassen die FDA für die Behandlung von Patienten mit ER+, PIK3CA-mutiertem Brustkrebs (5).Mehr als 95 % der menschlichen Gene codieren mehrere mRNA-Isoformen als Ergebnis des alternativen Spleißens, d. h. der unterschiedlichen Auswahl von intronischen/exonischen Sequenzen und der Verwendung alternativer Promotoren und Polyadenylierungsstellen am 3'-Ende, was die Proteindiversität erhöht (6, 7) .RNA-Spleißen ist ein kotranskriptionaler enzymatischer Prozess, durch den eine Vorläufer-mRNA in die reife mRNA umgewandelt wird, indem die nicht-kodierenden Regionen, die Introns, und die Ligation der kodierenden Regionen, der Exons (8), umgewandelt werden.Alternatives RNA-Spleißen bestimmt die Zelldifferenzierung, Entwicklung und Gewebeidentität (9), und fehlreguliertes Spleißen kann zur Tumorentstehung sowie zur Tumorentwicklung und Therapieresistenz beitragen (8, 10).Frühere Studien haben berichtet, dass der PI3K/AKT/mTOR-Weg die Funktion der Serin/Arginin-reichen (SR) Spleißfaktoren direkt reguliert (11–14).Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der PI3K-Signalweg das alternative Spleißen indirekt beeinflusst, indem er die Aktivität der SR-Proteinkinasen, SRPKs, moduliert (15–18).Es wurde gezeigt, dass AKT mit SRPKs interagiert und deren Autophosphorylierung und Kerntranslokation induziert, um SR-Proteine ​​zu aktivieren und alternatives Spleißen zu beeinflussen (17).Es wurde auch gezeigt, dass die duale Hemmung von PI3K und mTOR den Spleißfaktor hnRNPM hochreguliert und alternatives Spleißen in Ewing-Sarkom-Zellen induziert (19).Im Vergleich zu den umfangreichen Studien zu Proteinmodifikationen und Signalereignissen, die onkogenen PI3K-Varianten nachgeschaltet sind, wurde jedoch noch keine systematische und umfassende Untersuchung des Transkriptoms und des genomweiten alternativen Spleißens durchgeführt, das durch mutierte PI3K bei Brustkrebs moduliert wird.In dieser Studie wollten wir die genomweiten transkriptionellen Veränderungen und das alternative RNA-Spleißen und die Dynamik der Verwendung von Isoformen, die durch die Aktivierung des PI3K-Signalwegs in PIK3CA-Mutantenmodellen angetrieben werden, umfassend aufklären und ihre translationale Relevanz bei Brustkrebspatientinnen hinterfragen.Unsere Studie liefert die erste umfassende Analyse weit verbreiteter Spleißveränderungen, die durch onkogene PI3K bei Brustkrebs verursacht werden.Isogene Eltern- und heterozygote PIK3CAH1047R-Mutanten wurden von Horizon Discovery erworben.MCF-10A-Zellen wurden in DF-12-Medium gehalten, das mit 5 % gefiltertem Pferdeserum (Invitrogen), EGF (20 ng/μl; Sigma), Hydrocortison (0,5 mg/ml; Sigma), Choleratoxin (100 mg/ml; Sigma), Insulin (10 μg/ml; Sigma) und 1 % Penicillin/Streptomycin.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden in 6-Multiwell-Platten unter regulären Kulturbedingungen ausgesät, um eine korrekte Anheftung zu ermöglichen und eine Konfluenz von 75 % am Tag der Ernte sicherzustellen.Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) zugegeben wurde.Wo angegeben, wurden die Zellen mit DMSO als Kontrolle oder Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077 (100 nmol/l), GDC0068/ipatasertib (1 μmol/l) oder RAD001/Everolimus behandelt ( 100 nmol/l).Für die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und RT-qPCR-Experimente und zur Kontrolle der PI3K-Signalgebung durch Western Blot wurden die Zellen 4 Stunden lang behandelt, während für Western Blot-Analysen von PTK2/fokale Adhäsionskinase-verwandte Nicht-Kinase (FRNK)-Zellen 24 Stunden behandelt wurden.Embryonale Mausfibroblasten (MEF) wurden über ein Material Transfer Agreement (MTA; Ref. 20) erhalten und mit adenoviralem GFP (Elternzellen) oder adenoviralem Cre infiziert, um eine homozygote Pik3caH1047R-Mutation (Mutantenzellen) zu erhalten.MEFs wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert.MCF7 wurden von ATCC (ATCC HTB-22) bezogen und in DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin 1 %, unter Standardbedingungen gezüchtet.T47D wurden von ATCC (HTB-133) erworben und in RPMI, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin 1 %, unter Standardbedingungen gezüchtet.Alle Zellen wurden routinemäßig negativ auf Mycoplasma getestet.Die PI3Ka-spezifischen Inhibitoren Alpelisib und GDC0077, das PI3Kα/γ/δ Taselisib, der Pan-AKT-Inhibitor GDC0068/Ipatasertib, der mTORC1-Inhibitor RAD001/Everolimus wurden gekauft (Selleckchem).Der ON-TARGETplus Short-Interference RNA (siRNA) Smart Pool gegen SRSF1 (L-018672–01–0005), SRSF2 (L-019711–00–0005), SRSF3 (L-030081–00–0005), SRSF7 (L -015909–00–0005), CELF1 (:L-020166–00–0005), HNRNPC (L-011869–03–0005), TRA2B (L-007278–00–0005), AFMID (L-032645–02– 0005) und PTBP1 (L-003528–00–0005) oder Non-Targeting (D-001810–10–05) wurden von Horizon Discovery erworben.Mutante MCF10A-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen bei 30 % Konfluenz ausplattiert und 16 Stunden später wurden siRNA-Oligonukleotide unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific, 13778150) gemäß dem Protokoll des Herstellers bei einer Endkonzentration von 20 nmol/l transfiziert.Nach 72 Stunden wurden mutierte MCF10A-Zellen mit Alpelisib (1 μmol/L) in Hungermedien für 4 Stunden behandelt und dann für die RNA-Extraktion gesammelt.Die RNA wurde unter Verwendung des QIAGEN RNeasy Kits isoliert und die Retrotranskription wurde unter Verwendung des iScript cDNA-Synthesekits von Bio-Rad gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.cDNA wurde durch quantitative Echtzeit-PCR in einem ViiA 7-Echtzeit-PCR-System unter Verwendung von SYBR Select Master Mix von Applied Biosystems amplifiziert.Sequenzen der verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 gezeigt.Für Validierungsexperimente wurden MCF10A-Eltern- und -Mutantenzellen in 6-Multiwell-Platten unter regulären Kulturbedingungen ausgesät, um eine korrekte Anheftung zu ermöglichen und eine Konfluenz von 75 % am Tag der Ernte sicherzustellen.Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) zugegeben wurde.Die Zellen wurden dann mit DMSO oder mit den verschiedenen Inhibitoren des PI3K-Signalwegs in Hungermedien für 4 Stunden bei –37 °C behandelt.Die Zellen wurden dann schockgefroren und bis zur RNA-Extraktion bei –80 °C gelagert.Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.RNA aus MCF10A-Zellen wurde mit dem Illumina HiSeq 2000-Instrument bei 2 × 150 Nukleotid-Paired-End-Reads sequenziert.RNA aus MEF-Zellen wurde mit dem Illumina HISeq 2000-Instrument bei 2 × 100 Nukleotid-Paired-End-Reads sequenziert.Informationen zu RNA-seq-Analysen finden Sie unter Ergänzende Daten.Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer, ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Roche), lysiert.Gesamtproteinlysate wurden in Nupage 4 % bis 12 % Bis-Tris-Gradienten-Fertiggelen (Invitrogen) in MOPS-Puffer laufen gelassen.Membranen wurden unter Verwendung spezifischer Antikörper sondiert: PTK2/FAK (#3285S; RRID: AB_2269034) phosphoryliertes AKT (pAKT) (S473; #4060; RRID: AB_2315049), pAKT (T308; #13038; RRID: AB_2629447), Gesamt-AKT (# 4691; RRID: AB_915783), pS6 (S240/244; #5364; RRID: AB_10694233), pS6 (S235/236; #4858; RRID: AB_916156), HA-Tag (#3724; RRID: AB_1549585), V5-Tag (#13202; RRID: AB_2687461), β-Aktin (#4970S; RRID: AB_2223172) und Vinculin (#13901; RRID: AB_2728768) wurden von Cell Signaling Technology bezogen.Derselbe Antikörper wurde verwendet, um sowohl PTK2/FAK (125 kDa) als auch FRNK (43 kDa) nachzuweisen.Alle primären Antikörper wurden 1:1.000 verdünnt und sekundärer Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (GE Healthcare; RRID: AB_772206) (1:10.000) wurde verwendet.Die AFMID-202-Isoform wurde von Genewiz in einem pUC57-Vektor mit attB1- und attB2-Stellen in 5' bzw. 3' der cDNA bestellt und synthetisiert.Der Spenderklon wurde mit pLx302 (Addgene #25896) oder pIND20 (Addgene #44012) lentiviralen Vektoren unter Verwendung von Standard-Clonase II LR-Mix (Thermofisher; Katalog-Nr. 11791100) rekombiniert.Die Gateway-LR-Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.Nach effizienter Transformation und DNA-Reinigung wurden die Klone vor der Verwendung sequenziert.Als Vektorkontrolle für pLx302 AFMID-202 wurde pLx302 Luciferase verwendet.MCF10A PIK3CAH1047R-, MCF7- und T47D-Zellen, die Tet-FRNK-EGFP oder pIND20 AFMID-202 stabil exprimieren, wurden 24 Stunden vor dem Initiationsassay gleichmäßig in einer 48-Well-Platte (104) in 3 biologischen Wiederholungen für jeden Zustand ausgesät.Für die Zelllinien, die stabil Doxycyclin-induzierte Vektoren tragen, wurde volles oder 1 mg/ml Doxycyclin enthaltendes Medium hinzugefügt.Die Zellzahl wurde am Tag 0, 3 und 6 mit einem Countess 3 Automated Cell Counter (Thermofisher Scientific) gezählt.MCF10A-PIK3CAH1047R-Mutantenzellen, die stabil einen Doxycyclin-induzierbaren Vektor für FRNK-EGFP-Überexpression tragen, wurden 48 Stunden vor dem Assay in eine 12-Multiwell-Platte (1,5 × 105) ausgesät, um am Tag des Assays eine vollständig konfluente Monoschicht zu erhalten.24 Stunden nach dem Ausplattieren wurde 1 mg/ml Doxycyclin zu den Medien gegeben, um die FRNK-EGFP-Expression zu induzieren.Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion wurde eine ausreichende FRNK-EGFP-Expression unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Evos M5000, Thermo Fisher Scientific) bewertet.Als nächstes wurde eine gerade Wunde in der Mitte jeder Vertiefung unter Verwendung einer sterilen p200-Spitze geschabt, um eine Lücke in der konfluenten Monoschicht zu erzeugen.Die Vertiefungen wurden dann vorsichtig mit Hungermedium (ohne Serum, EGF und Insulin) gewaschen, um abgelöste Zellen zu entfernen, und mit frischem Hungermedium aufgefüllt.Die Wunden wurden unter Verwendung des Mikroskops Evos M5000 (Thermo Fisher Scientific) unmittelbar nach dem Schaben (Zeit 0 Stunde) und zu verschiedenen Zeitpunkten für eine Dauer von maximal 24 Stunden abgebildet, um den Beitrag der Zellproliferation zum Füllen der Lücke zu reduzieren.Die Wundfläche wurde mit FiJi (ImageJ) quantifiziert.MCF7- und T47D-Elternzellen wurden gezählt und 5.000 Zellen/Vertiefung wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und über Nacht in Vollmedium inkubiert.Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 1 × PBS gewaschen, bevor das Hungermedium (ohne FBS) hinzugefügt wurde.Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit steigenden Dosen von Alpelisib in Gegenwart von H3B-8800 (50 nmol/L), E7070 (100 nmol/L) oder DMSO-Kontrolle für 5 Tage behandelt.Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Zellproliferations-MTT-Kit (Sigma-Aldrich-Kat.-Nr. 11465007001) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.Für die T47D-Xenotransplantatstudie wurden 0,72 mg/90d-Freisetzungs-Östrogenpellets in 6 Wochen alte weibliche athymische Nacktmäuse 3 Tage vor der Tumorzelltransplantation implantiert.Zehn Millionen T47D-Zellen pro Maus wurden orthotop transplantiert.Für die MCF7-Xenotransplantat-Studie wurden 0,18 mg/90d-Freisetzungs-Östrogenpellets in 6 Wochen alte weibliche NOD-scid-Gamma-Mäuse 3 Tage vor der Tumorzelltransplantation implantiert.Zehn Millionen MCF7-Zellen pro Maus wurden subkutan transplantiert.Das von Patientinnen stammende Brustkrebs-Xenotransplantat mit PIK3CAH1047R-Mutante wurde wie folgt erzeugt: 6 Wochen alten weiblichen NOD-scid-Gamma-Mäusen wurden subkutan Proben implantiert, die frisch von Patienten im Memorial Sloan Kettering (MSK) unter einem von MSK genehmigten Institutional Review Board (IRB) entnommen wurden ) Bioprobenprotokoll Nr. 06–107.Tumore entwickelten sich innerhalb von 2 bis 4 Monaten und wurden durch serielle Transplantation auf weitere Mäuse ausgedehnt.Die Behandlung wurde begonnen, als das Tumorvolumen etwa 200 mm3 erreichte.Xenotransplantate wurden randomisiert und mit Alpelisib (25 mg/kg, oral 5 Tage die Woche) oder Vehikel als Kontrolle (0,5 % Methocel, oral 5 Tage die Woche) dosiert.Am Ende der Behandlungen (20–30 Tage) wurden die Tiere getötet und Tumore für Western Blot und RNA-Analysen gesammelt.Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien gehalten, die vom MSK Institutional Animal Care and Use Committee und dem Research Animal Resource Center genehmigt wurden.Patienten mit bekannten PIK3CA-Mutationen wurden in eine offene Phase-I-Dosiseskalationsstudie mit täglich oralem GDC-0077 allein (Arm A) in Kombination mit einer endokrinen Therapie mit oder ohne Palbociclib aufgenommen (Arm C: GDC-0077 + Letrozol; ARM D: GDC-0077 + Fulvestrant; Arm B: GDC-0077 + Letrozol + Palbociclib; Arm E: GDC-0077 + Fulvestrant + Palbociclib; Arm F: GDC-0077 + Fulvestrant + Palbociclib + Metformin-Prophylaxe; NCT03006172).Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.Die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien (Belmont-Bericht) durchgeführt.Die Patienten wurden in MSK-IRB Nr. 12–245 aufgenommen, und es wurde eine Kernbiopsie entnommen und für RNA-seq-Analysen verwendet.Weitere Einzelheiten zur Aufnahme von Patienten in diese Studie finden Sie in der ergänzenden Datendatei.Informationen zur Patientenkohorte finden sich in der Ergänzungstabelle S2.Für jedes unabhängige In-vitro-Experiment wurden mindestens drei Experimente durchgeführt, um eine angemessene statistische Aussagekraft zu gewährleisten.Einweg-ANOVA und ungepaarter t-Test wurden auf dem GraphPad PRISM durchgeführt, um Proben in RT-qPCR- bzw. RIP-qPCR-Experimenten zu vergleichen (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001) .Alle Informationen zu durchgeführten statistischen Tests, 'n'-Werten und P-Werten pro Experiment finden Sie in den Abbildungslegenden, Abbildungen und Ergebnissen.Das für alle statistischen Analysen verwendete Konfidenzniveau betrug 0,95 (α = 0,05), sofern nicht anders angegeben.Rechnerische Analysen und Statistiken aller Assays sind in der ergänzenden Datendatei enthalten.Die während dieser Studie generierten Datensätze [RNA-seq/assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq) fastq files] sind in der Gene Expression Omnibus-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE157858 verfügbar.Die Patienten-RNA-seq-fastq-Dateien sind in der dbgap-Datenbank unter der Nummer: phs002840.v1.p1 verfügbar.Um die dem PI3K-Weg nachgeschaltete globale Transkriptomregulation zu verstehen, führten wir Paired-End-Long-Read-RNA-Seq in zwei isogenen Knock-in-Zellmodellen durch, die die aktivierende Mutation PIK3CAH1047R tragen: MEFs und humane nichtmaligne Brustepithelzellen (MCF10A).(Ergänzende Abb. S1A; Ergänzende Abb. S1B und S1C).Um die Auswirkungen der PI3K-Hemmung zu beurteilen, führten wir in beiden Modellen nach der Behandlung mit PI3Kα-spezifischen Inhibitoren auch RNA-seq durch.Eine Analyse der differentiellen Genexpression ergab, dass Tausende von Genen durch PIK3CAH1047R im Vergleich zu elterlichen Kontrollzellen in MCF10A und MEF verändert wurden (Abb. 1A; ergänzende Abb. S1D–S1F), deren Expression auch durch PI3Kα-Hemmung umgekehrt wurde (Abb. 1B; Ergänzende Abb. S1G, Ergänzende Tabelle S3).Diese Beobachtungen zeigten, dass PIK3CAH1047R in erster Linie für Veränderungen der Genexpression in diesen isogenen Modellen verantwortlich war.Globale Veränderungen der Genexpression und des RNA-Spleißens im Zusammenhang mit der Expression des mutierten PIK3CA-Signalwegs.A, Venn-Diagramm-Überlappung von differentiell exprimierten Genen mit einem FDR-angepassten P < 0,05 und einem absoluten Fold Change > 0,2 unter Vergleichen: mutante vs. parentale, mutante + Alpelisib vs. mutante und parentale + Alpelisib vs. parentale MCF10A-Zellen.B, Streudiagramm der log2-fachen Veränderungen der Genexpression in MCF10A-Mutante vs. Eltern auf der x-Achse und Mutante + Alpelisib vs. Mutante auf der y-Achse.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Gene (FDR < 0,05 und absolute fold change > 0,2);graue Punkte, nicht signifikant differentielle Gene.Pearson-Korrelationskoeffizient r ist für alle Punkte in grau oder signifikant unterschiedliche Gene, rote Punkte, dargestellt.C, C2 Reaktom-mRNA-Spleißweg-Anreicherung in den angegebenen Vergleichen.D, Streudiagramm der log2-fachen Änderungen von JunctionSeq, das Mutante vs. Elternzellen auf der X-Achse und Mutante + Inhibitor vs. Mutante MCF10A-Zellen auf der Y-Achse zeigt;Ereignisse, die in PI3K-Aktivierungs- und PI3K-Hemmungsgruppen oder nur in PI3K-Aktivierungs- oder nur PI3K-Hemmungsgruppen signifikant sind, sind rot, orange bzw. blau.E, Venn-Überlappung von Genen, die signifikant unterschiedliche exonische Regionen enthalten.Der Schnittpunkt der gleichen signifikant unterschiedlichen exonischen Regionen mit entgegengesetzter log2-facher Änderung bei Mutante vs. Eltern und Mutante + Alpelisib vs. Mutante wurde 188 einzigartigen Genen zugeordnet.F, Der Prozentsatz von alternativ gespleißten Isoformen wurde unter Verwendung von 8 möglichen Transkriptionsereignissen kommentiert.MES, multiples Exon-Skipping;ATSS, alternative Transkriptionsstartstelle;ATTS, alternative Transkriptionsterminationsstelle;ES, Exon-Skipping;IR, Intronretention;A3, alternative 3'-Spleißstellen;A5, alternative 5'-Spleißstellen;MEE, sich gegenseitig ausschließende Exons.G, ein MA-Diagramm von Isoformen.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Isoformen;blaue Punkte, nicht signifikante alternativ gespleißte Isoformen.Validierte Kandidaten werden mit Isoform-Namen gekennzeichnet.Globale Veränderungen der Genexpression und des RNA-Spleißens im Zusammenhang mit der Expression des mutierten PIK3CA-Signalwegs.A, Venn-Diagramm-Überlappung von differentiell exprimierten Genen mit einem FDR-angepassten P < 0,05 und einem absoluten Fold Change > 0,2 unter Vergleichen: mutante vs. parentale, mutante + Alpelisib vs. mutante und parentale + Alpelisib vs. parentale MCF10A-Zellen.B, Streudiagramm der log2-fachen Veränderungen der Genexpression in MCF10A-Mutante vs. Eltern auf der x-Achse und Mutante + Alpelisib vs. Mutante auf der y-Achse.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Gene (FDR < 0,05 und absolute fold change > 0,2);graue Punkte, nicht signifikant differentielle Gene.Pearson-Korrelationskoeffizient r ist für alle Punkte in grau oder signifikant unterschiedliche Gene, rote Punkte, dargestellt.C, C2 Reaktom-mRNA-Spleißweg-Anreicherung in den angegebenen Vergleichen.D, Streudiagramm der log2-fachen Änderungen von JunctionSeq, das Mutante vs. Elternzellen auf der X-Achse und Mutante + Inhibitor vs. Mutante MCF10A-Zellen auf der Y-Achse zeigt;Ereignisse, die in PI3K-Aktivierungs- und PI3K-Hemmungsgruppen oder nur in PI3K-Aktivierungs- oder nur PI3K-Hemmungsgruppen signifikant sind, sind rot, orange bzw. blau.E, Venn-Überlappung von Genen, die signifikant unterschiedliche exonische Regionen enthalten.Der Schnittpunkt der gleichen signifikant unterschiedlichen exonischen Regionen mit entgegengesetzter log2-facher Änderung bei Mutante vs. Eltern und Mutante + Alpelisib vs. Mutante wurde 188 einzigartigen Genen zugeordnet.F, Der Prozentsatz von alternativ gespleißten Isoformen wurde unter Verwendung von 8 möglichen Transkriptionsereignissen kommentiert.MES, multiples Exon-Skipping;ATSS, alternative Transkriptionsstartstelle;ATTS, alternative Transkriptionsterminationsstelle;ES, Exon-Skipping;IR, Intronretention;A3, alternative 3'-Spleißstellen;A5, alternative 5'-Spleißstellen;MEE, sich gegenseitig ausschließende Exons.G, ein MA-Diagramm von Isoformen.Rote Punkte, signifikant unterschiedliche Isoformen;blaue Punkte, nicht signifikante alternativ gespleißte Isoformen.Validierte Kandidaten werden mit Isoform-Namen gekennzeichnet.Die Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA; Ref. 21) identifizierte die Zellproliferation (MYC- und E2F-Ziele, G2-M-Checkpoint) und den Stoffwechsel (Glykolyse, Fettsäurestoffwechsel, Adipogenese) als die am stärksten veränderten Wege in PIK3CAH1047R im Vergleich zu den Elternzellen (Supplementary Tabelle S4).Darüber hinaus wurden RNA-Bindung, RNA-Verarbeitung und mRNA-Spleißen auch von GSEA in der Reactome-Datenbank als signifikant angereicherte Wege in Mutanten im Vergleich zu Elternzellen sowie als Reaktion auf die PI3Kα-Hemmung als negativ angereichert identifiziert (Abb. 1C; ergänzende Abb. S1H; Ergänzungstabelle S4), was darauf hindeutet, dass das RNA-Spleißen ein wichtiger Effektorweg nach dem onkogenen PI3K sein könnte.Um das durch die PI3K-Aktivierung regulierte Netzwerk von Transkriptionsfaktoren (TF) zu definieren, führten wir TF-Motivanalysen in unseren Modellen durch.Wir identifizierten die AKT-Substrate FOXO (22), NRF1 (23) und AR (24) sowie E2F-Proteine ​​(25), MYC (26), ELK1 (27), STAT5 (28), TCF4 (27), von denen zuvor beschrieben wurde, dass sie durch den PI3K-Signalweg reguliert werden.Unsere Analysen sagten auch eine Reihe von TFs wie PR, GR, RORA, YY1, AP1 (Ergänzungstabelle S4) voraus, über deren Regulierung über den PI3K-Weg zuvor nicht berichtet worden war.Um die Relevanz dieser TFs bei der Modulation von Transkriptionsausgaben weiter zu definieren, haben wir die Chromatinlandschaft von mutierten und elterlichen MCF10A-Zellen unter Verwendung der ATAC-seq abgefragt.Weit verbreitete (n = 8.330) Änderungen der Chromatinzugänglichkeit wurden durch mutierte PI3K im Vergleich zu Elternzellen vermittelt (ergänzende Abb. S1I).In Übereinstimmung mit unseren RNA-seq-TF-Aktivitätsanalysen identifizierte die De-novo-Motivanalyse AP1, ZEB1, YY2, Kernrezeptor, ELK, TCF und STAT unter den wichtigsten TFs-Motiven, die bei Aktivierung des PI3K-Signalwegs angereichert wurden (ergänzende Abb. S1J).Insgesamt identifizierten unsere integrierten RNA-seq- und ATAC-seq-Analysen einen robusten Satz von TFs, deren Funktion möglicherweise durch die Aktivierung des PI3K-Signalwegs reguliert wird.Frühere Studien haben den PI3K/AKT/mTOR-Weg mit spezifischen Komponenten der Spleißmaschinerie in Verbindung gebracht (11–17).Es wurde jedoch nicht über eine systematische Untersuchung des Spleißens bei Aktivierung und Hemmung des PI3K-Signalwegs durch RNA-seq berichtet.Zu diesem Zweck führten wir zunächst eine RNA-Splicing-Analyse zur differenziellen Verwendung bekannter Exons und Splice-Junctions unter Verwendung des JunctionSeq-Algorithmus (29) durch.Die Anzahl der identifizierten signifikant veränderten Ereignisse war in mutierten MCF10A-Zellen im Vergleich zu Elternzellen (n = 4.444) und auch im Vergleich zu mit PI3Kα-Inhibitor behandelten mutierten Zellen (n = 1.539) größer.Die gleiche Analyse in MEF-Zellen identifizierte auch weit verbreitete RNA-Splicing-Veränderungen, die durch die PIK3CAH1047R-Mutation (n = 2092) und durch die PI3Kα-Hemmung (n = 735; Ergänzungstabelle S5) vermittelt wurden.Obwohl bekannt ist, dass alternatives Spleißen gewebe- und artspezifisch ist (30), identifizierte die Überschneidung unterschiedlich falsch gespleißter Gene in unseren Human- und Mausmodellen Ereignisse in 6 Genen, nämlich CCDN3, CKAP4, YPEL, RPL27, COG5 und IP6K2.Die umgekehrte Korrelation signifikanter Ereignisse zwischen Mutantenzellen gegenüber Eltern- und Mutantenzellen gegenüber PI3K-Hemmung lieferte den Beweis, dass die Behandlung mit PI3Kα-Inhibitoren RNA-Splicing-Ereignisse sowohl in MEF- als auch in MCF10A-Linien umkehren kann (Abb. 1D; ergänzende Abb. S1K).Wir haben einen zuverlässigen Satz von 618 Isoformen in MCF10A-Zellen und 283 Isoformen in MEFs etabliert, die statistisch signifikante alternative Spleißereignisse hervorriefen, die zwischen PIK3CAH1047R und Elternzellen umgekehrt korrelierten und auch durch PI3Kα-Hemmung gerettet wurden (Abb. 1D und E; ergänzende Abb. S1L). .Die Annotation dieser Splicing-Ereignisse ergab, dass die häufigsten Änderungen der Isoform-Ebene Exon-Skipping von einzelnen und mehreren Exons und alternative Terminierungs- und Startstellen der Transkription waren (Abb. 1F; ergänzende Abb. S1M; ergänzende Tabelle S5).Eine Analyse der Genontologie (GO) der 618 Isoformen in MCF10A identifizierte die Anreicherung mehrerer biologischer Wege, darunter: Translation, RNA-katabolischer Prozess, mRNA- und Peptidstoffwechselprozess, Ribosomenbiogenese und Zellzyklus (Ergänzungstabelle S6).Neben JunctionSeq (29) haben wir auch zuverlässig das RNA-Spleißen und Änderungen der Verwendung von Isoformen mit den etablierten Algorithmen IsoformSwitchAnalyzerR (31), rMATS (32) und SUPPA2 (33) bewertet.Für Spleißvalidierungen haben wir die signifikantesten Kandidaten ausgewählt, die von mindestens zwei Algorithmen erkannt wurden, wobei für jeden Algorithmus dasselbe Spleißereignis durch PI3Kα-Hemmung rückgängig gemacht wurde.Unter den 71 Genen, die durch mindestens zwei Algorithmen signifikant gespleißt wurden (Ergänzungstabelle S7), wurden 10 Kandidaten mit Genfunktionen, die an Spleißen, Migration, Zellwachstum und Stoffwechsel beteiligt sind, zufällig ausgewählt und validiert: ​​AFMID, kodierend für Arylformamidase, beteiligt an Abbau von Tryptophan;CCND3, das das den Zellzyklus fördernde Cyclin D3 codiert;HNRNPC, das für das heterogene nukleare Ribonukleoprotein C des Spleißfaktors kodiert;IP6K2, das die Inositolhexaphosphatkinase 2 kodiert;MTUS1, das für das Mikrotubuli-assoziierte Gerüstprotein 1 kodiert;PTK2/FAK, kodierend für die fokale Adhäsionskinase;SRP68, das das Signal Recognition Particle 68 codiert;SPRK2, das für den Spleißfaktor SRSF-Kinase 2 kodiert;RRAS2, Codierung des Signalwandlers RAS bezogen auf 2;und UNKL, das für eine mutmaßliche E3-Ubiquitin-Ligase Unk wie Zinkfinger kodiert (Fig. 1G).Als nächstes validierten wir Spleißereignisse innerhalb der 10 Kandidaten in elterlichen und mutierten MCF10A-Zellen mit oder ohne Behandlung mit Alpelisib.Wir beobachteten eine Verarmung der gespleißten Regionen von AFMID, CCND3, MTUS1, SRP68, RRAS2, UNKL, PTK2/FAK und SRPK2 sowie eine Anreicherung der gespleißten Regionen von HNRNPC- und IP6K2-Isoformen in mutierten Zellen im Vergleich zu Elternzellen, das wurden durch PI3K-Hemmung umgekehrt, was mit unseren Computeranalysen übereinstimmte (Abb. 1G und 2A).Als Kontrolle blieben die Mengen ausgewählter ungespleißter Regionen für jedes Transkript konstant.Als nächstes untersuchten wir die alternativen Spleißereignisse in MCF7 (PIK3CAE545K), MDA-MB-453 (PIK3CAH1047R) und T47D (PIK3CAH1047R) und in vivo unter Verwendung von MCF7- und T47D-abgeleiteten Xenotransplantaten und einem PIK3CAH1047R-Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX)-Modell, das damit behandelt wurde Alpelisib oder Vehikel täglich für mehr als 15 Tage (ergänzende Abb. S2A und S2B).In drei PIK3CA-mutierten Brustkrebszelllinien wurden die alternativen Spleißereignisse von AFMID, CCND3, HNRNPC, PTK2, RRAS2, SRPK2 und UNKL bei der Behandlung mit Alpelisib in mindestens zwei Modellen gerettet (Abb. 2B; ergänzende Abb. S2C).Eine In-vivo-Validierung der Kandidaten-Spleißmuster in MCF7- oder T47D-abgeleiteten Xenograft-Tumoren und in den PDX-Modellen zeigte, dass die nachfolgenden Spleißveränderungen einer Reihe von Kandidaten auch in mindestens zwei Modellen nach Alpelisib-Behandlung beobachtet wurden (ergänzende Abb. S2B und S2C).Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass der PI3K-Signalweg ein entscheidender Regulator des RNA-Spleißens ist.PIK3CA-abhängiges alternatives RNA-Spleißen und Rekrutierung von RBPs in mehreren Brustmodellen.A, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 10 verschiedenen Genen in MCF10A-Zellen beobachtet wurden.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden 4 Stunden lang entweder mit DMSO oder Alpelisib (1 μmol/l) in Hungermedien behandelt.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer ungespleißten Region als Kontrolle übereinstimmten.Die Expressionsniveaus wurden auf Aktin normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.B, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 8 verschiedenen Genen in MCF7- oder MDA-MB-453-Brustkrebszellen beobachtet wurden.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer ungespleißten Region als Kontrolle übereinstimmten.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.C, MCF10A-Eltern- und Mutantenzellen wurden entweder mit DMSO als Kontrolle oder mit Alpelisib (1 μmol/l), Taselisib (100 nmol/l), GDC0077 (100 nmol/l), GDC0068/ipatasertib (1 μmol/l) oder behandelt RAD001/Everolimus (100 nmol/L) unter Hungerbedingungen für 4 Stunden.RT-qPCR wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die zur Erkennung von PTK2/FAK- und AFMID-Splicing-Ereignissen und Primern, die mit einer ungespleißten Region übereinstimmen, als Kontrolle verwendet wurden.Die Expressionsniveaus wurden auf ACTIN normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.D, Motivanalyse der oberen angereicherten RBPs in den alternativ gespleißten Regionen der validierten Kandidaten in A. E, MCF10A PIK3CAH1047R-Zellen wurden 72 Stunden lang mit siRNA transfiziert, die auf die RBPs abzielt, und dann mit Alpelisib (1 μmol/L) in Hunger behandelt Medien für 4 Stunden.RT-qPCR für die angegebenen Gene wurde wie in A und C durchgeführt. Kreise, unabhängige Experimente.Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Proben zu vergleichen.*, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001;****, P < 0,0001;ns, nicht signifikant.PIK3CA-abhängiges alternatives RNA-Spleißen und Rekrutierung von RBPs in mehreren Brustmodellen.A, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 10 verschiedenen Genen in MCF10A-Zellen beobachtet wurden.Eltern- und Mutantenzellen von MCF10A wurden 4 Stunden lang entweder mit DMSO oder Alpelisib (1 μmol/l) in Hungermedien behandelt.Für jedes Gen wurde RT-qPCR unter Verwendung von Primern durchgeführt, die so konzipiert waren, dass sie das spezifische Spleißereignis erkennen, und Primern, die mit einer nicht gespleißten Region als Kontrolle übereinstimmen.Die Expressionsniveaus wurden auf Aktin normalisiert und sind als fold change relativ zur parentalen DMSO-Probe gezeigt.Kreise, unabhängige Experimente.B, Validierung durch RT-qPCR von Spleißereignissen, die in 8 verschiedenen Genen in MCF7- oder MDA-MB-453-Brustkrebszellen beobachtet wurden.